9 11-18 Khang Dân Cây bình thường, lá biến vàng ựỏ 18/05 Bắc Giang 10 11-20 Nhị ưu 838 Cây lùn, lá biến vàng ựỏ 11/05 Hòa Bình
4.2.7.Kiểm tra nồng ựộ virus trong quá trình tinh chiết
Quá trình làm sạch sản phẩm tinh chiết thường gồm nhiều bước li tâm nhằm loại bỏ tàn dư hoặc sản phẩm của dịch cây (protein, diệp lục...), các bước này thường cũng loại bỏ một số virus. Do vậy, ựể có một kháng huyết thanh ựặc hiệu virus phục vụ trong chuẩn ựoán thì ngay từ những khâu ựầu tiên như vật liệu tinh chiết, sản phẩm tinh chiết ựều phải chứa hàm lượng virus ựủ lớn và sạch ựể kắch thắch hiệu quả hệ miễn dịch của thỏ hình thành kháng thể.
Chúng tôi ựã thực hiện thử nghiệm ELISA dùng kháng huyết thanh là huyết tương vừa thu ựược ựể kiểm tra sự có mặt của virus trong 3 sản phẩm ựược thực hiện ở bước siêu li tâm là dịch trước siêu li tâm, dịch trên tủa sau siêu li tâm và cặn virus. Kết quả ựược trình bày ở Bảng 4.8 và Hình 4.10.
Bảng 4.8. Kiểm tra ELISA hàm lượng virus RYSV trong các sản phẩm thu ựược trong quá trình tinh chiết phân tử virus
STT Sản phẩm trong quá trình siêu li tâm độ hòa loãng sản phẩm Giá trị mật ựộ quang OD sau 1 giờ
1 Dịch trước siêu li tâm 1/10 0.139
1/10 0.133
2/10 0.138
2
Dịch trên tủa sau li tâm
3/10 0.131
1/10 0.264
2/10 0.278
3
Cặn virus hòa trong ựệm phosphat có ựường
3/10 0.238
1/10 0.252
4 Cặn virus hòa trong ựệm
phosphat không có ựường 2/10 0.265
5 đệm carbonate 0.112
Ghi chú: độ hòa loãng phản ứng chéo 1/10, ựộ hòa loãng của kháng thể chuột liên kết AP là 1/7500.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 41
Hình 4.10. Kiểm tra ELISA ựánh giá hàm lượng virus ở các sản phẩm của quá trình tinh chiết.
Nhận xét :
Kết quả kiểm tra ELISA cho thấy giá trị OD của dịch virus trước siêu li tâm và sau siêu li tâm từ 0.131 ựến 0.139, cao hơn so OD của ựệm ựối chứng (0.112) chứng tỏ trong 2 sản phẩm này ựều chứa virus. Tuy nhiên, giá trị OD của dịch trên tủa sau siêu li tâm cao hơn không nhiều so với dịch trước siêu li tâm chứng tỏ quá trình siêu li tâm ựã không kết tủa triệt ựể virus. Khả năng này có thể do 2 lý do là (i) lực ly tâm (g) chưa ựủ mạnh hoặc thời gian li tâm chưa ựủ lâu ựể kết tủa triệt ựể virus, hoặc (ii) một số phân tử virus ựã liên kết với các cấu tử tế bào lớn dẫn tới không thể kết tủa hiệu quả trong ựiều kiện siêu li tâm ựã ựược thực hiện trong nghiên cứu nàỵ Tuy nhiên việc ựánh giá chắnh xác nguyên nhân và cải thiện kêt quả tinh chiết rất phức tạp.
Kết quả kiểm tra ELISA cũng cho thấy các giá trị OD trung bình của mẫu cặn virus ựược hòa trong ựệm phosphat có ựường là 0.260 và trong ựêm phosphat không có ựường là 0.268. Các giá trị OD cao này chứng tỏ siêu li tâm ựã kết tủa một lượng lớn phân tử virus tự do trong dịch chiết. Hậu quả là cặn virus, sau khi tinh chiết thêm qua nệm ựường ựã có thể ựủ ựể tạo kháng huyết thanh chẩn ựoán.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 42