Dung dịch pha mẫu là dung dịch PBS pH 7,2.
- Dụng cụ
Bộ dụng cụ micropipette, đĩa 96 giếng làm HA, HI.
*Tiến hành phản ứng HA,HI
Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA)
Phản ứng HA dùng để chuẩn độ kháng nguyên chuẩn H5 và kháng nguyên (là virus) phân lập từ bệnh phẩm. Dùng đĩa làm phản ứng ngưng kết đáy chữ V gồm 12 cột và 8 hàng.
* Các bước tiến hành phản ứng
+ Nhỏ 25 µl PBS 0,01 M (pH = 7,2) vào đĩa 96 giếng chữ V từ giếng thứ 1 đến giếng 12 của mỗi hàng.
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………45
45
+ Nhỏ 25 µl kháng nguyên chuẩn hoặc kháng nguyên phân lập vào các giếng đầu từ A1 - H1.
+ Tiếp tục pha loãng kháng nguyên kiểm tra theo cơ số 2 bằng cách chuyển 25 µl từ giếng 1 đến giếng thứ 2 và tuần tự đến giếng 11 rồi bỏ đi 25 µl.
+ Giếng 12 dùng đối chứng chứa: 25 µl PBS và 25 µl hồng cầu gà 1%.
+ Nhỏ 25 µl hồng cầu gà 1% vào các giếng của đĩa phản ứng.
+ Lắc nhẹ bằng tay hoặc bằng máy. Ủ đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng trong thời gian khoảng 40 phút, sau đó đọc kết quả.
* Đọc kết quả
+ Phản ứng âm tính: Hồng cầu lắng đều ở dưới đáy giếng thành chấm tròn.
+ Phản ứng dương tính: Xảy ra hiện tượng ngưng kết, hồng cầu ngưng kết thành cụm lấm tấm xung quanh giếng.
+ Đọc hiệu giá ngưng kết: Hiệu giá ngưng kết kháng nguyên được đánh giá ở dộ pha loãng cao nhất còn có phản ứng ngưng kết xảy ra.
Hình 2.2. Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
Phản ứng HI để phát hiện kháng thể suptype H5 (hoặc các suptype khác) đồng thời phát hiện sự ức chế hiện tượng ngưng kết hồng cầu. Từ đó đánh giá hiệu lực vaccine sau tiêm phòng.
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………46
46
Huyết thanh kiểm tra là huyết thanh gà nên không cần xử lý bằng RDE.
* Các bước tiến hành phản ứng
+ Đánh dấu mẫu huyết thanh cần kiểm tra lên đĩa 96 giếng đáy chữ V.
+ Nhỏ 25 µl PBS vào các giếng của đĩa 96 giếng.
+ Nhỏ 25 µl huyết thanh vào giếng đầu tiên.
+ Tiếp tục pha loãng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cách lấy 25 µl huyết thanh từ giếng 1 chuyển sang giếng 2 trộn đều với PBS của giếng, sau đó lại chuyển 25 µl từ giếng 2 sang giếng 3 cứ như vậy huyết thanh được pha loãng đến giếng 11 thì hút bỏ đi 25 µl huyết thanh. Giếng 12 dùng để đối chứng, không có kháng nguyên.
+ Nhỏ 25 µl kháng nguyên 4 HA đã chuẩn bị vào các giếng từ giếng 1 - 11 trừ hàng cuối. Thêm 25 µl PBS vào hàng đối chứng hồng cầu (giếng 12).
+ Lắc nhẹ đĩa và ủở nhiệt độ phòng 45 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Nhỏ 25 µl dung dịch hồng cầu 1% vào tất cả các giếng của đĩa.
+ Lắc nhẹ đĩa, để đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng 40 phút. Đọc kết quả.
* Đọc kết quả
Phản ứng dương tính nếu hồng cầu lắng xuống đáy giếng thành chấm tròn. Hiệu giá HI của mẫu được tính ở độ pha loãng huyết thanh cao nhất còn có hiện tượng ức chế ngưng kết hồng cầu. Huyết thanh đối chứng âm tính phải có hiệu giá ≤ 1/4 (2 log2).
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………47 47 Tiêu chí đánh giá
- Theo Công văn số 623 TY - DT ngày 04/05/2007 về việc hướng dẫn giám sát sau tiêm phòng cúm gia cầm năm 2007 của Cục Thú y, hiệu giá HI ≥