triển vọng
Sau khi kiểm tra khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn đã phân lập được, chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA cao nhất để thực hiện phản ứng PCR với mồi 16S - rRNA và so sánh với dữ liệu trên ngân hàng gene NCBI để định danh vi khuẩn.
Quy trình trích DNA từ khuẩn lạc của Trần Nhân Dũng (2011)
- Chọn 10 khuẩn lạc ròng, cho vào tuýp 2,2 ml (Ưu tiên chọn những khuẩn lạc lẻ, rời) - Cho 1 viên bi sắt vào tuýp và lắc bằng máy lắc.
- Cho vào 1 ml Lysis buffer, lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
- Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 5 phút, lấy phần dung dịch chuyển sang tuýp mới. - Cho một lượng tương đương Ethanol 95%, ly tâm 13000 rpm/5 phút, bỏ phần dung dịch phía trên.
- Rửa phần tủa bằng 500 µl Ethanol 70%, ly tâm 13000 rpm/5 phút. - Sấy khô chân không trong 10 phút (450C).
- Hòa tan trong 100 ul TE 0.1X. - Trữ ở -20oC..
Sau khi ly trích DNA từ các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá, phản ứng PCR gen 16S-rDNA(Lane, 1991) sử dụng đoạn mồi:
27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’
1492R 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’
Sau khi trích DNA các dòng vi khuẩn, sẽ tiến hành phản ứng PCR.
Bảng 7 : Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen của vi khuẩn nội sinh
Bước phản ứng Tên bước Số lượng chu kỳ Nhiệt độ ( o C) Thời gian 1 Biến tính 95 5 phút 2 Biến tính Gắn mồi Kéo dài 30 95 53 72 1 phút 30 giây 90 giây 3 Kéo dài 72 5 phút
Chuẩn bị gel agarose 1% với thể tích 40 ml. Cân 0,4g agarose cho vào chai nắp xanh. Đong 40 ml dung dịch TE 1X cho vào chai và lắc nhẹ cho agarose tan đều. Đặt chai vào lò vi sóng, đun khoảng 5 phút để cho agarose tan hoàn toàn và tạo thành dung dịch trong suốt. Lấy chai ra để nguội khoảng 55o - 60oC rồi bổ sung 0,8 μl Ethidium bromide, lắc nhẹ đều. Rót dung dịch vào góc dưới của khuôn gel đã được chuẩn bị, tránh tạo bọt khí. Để khoảng 45 phút cho gel nguội và đặc lại rồi lấy lược ra khỏi khuôn.
Đặt khuôn gel vào bể điện di dung dịch TE buffer 1X cho ngập gel. Load các mẫu sản phẩm PCR vào mỗi giếng với thể tích 10 μl bao gồm 8 μl mẫu trộn với 2 μl loading buffer. Sau cùng, load 4 μl DNA thang chuẩn 100 bp vào giếng. Mở nguồn điện, cài đặt cho thiết bị ở 95 Vol trong 80 - 90 phút. Quan sát thấy chất chỉ thị màu
xanh di chuyển gần cuối gel, tắt nguồn điện, lấy khuôn gel ra để chụp hình. Chụp hình gel đã điện di sản phẩm PCR.
Sau khi có sản phẩm điện di, gửi sản phẩm PCR giải trình tự và định danh tại Công ty Macrogen, Hàn Quốc.