Thu mẫu:
Hai mẫu Diếp cá được thu từ hai xã thuộc huyện Hòn Đất ở tỉnh Kiên Giang Dùng dao lấy toàn bộ( rễ, thân, lá) cây Diếp cá, bỏ vào bọc lylon và mang về phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật để xử lý mẫu và phân lập.
Lấy mẫu đất mang về phòng thí nghiệm vi sinh vật để đo độ pH của đất
Xử lý mẫu và phân lập
Rửa thật sạch đất bám ở rễ, thân và lá dưới vòi nước, để ráo nước
Khử trùng nước cất, bình tam giác (để đựng mẫu khử), eppendorf, đầu col xanh, col vàng, môi trường PDA, cối, chày. Việc khử trùng mẫu được thực hiện trong
Sau đó cắt rễ, thân và lá thành những đoạn nhỏ 2 – 3 cm (để riêng từng bộ phận) cho từng bộ phận mẫu vào cốc thủy tinh riêng biệt và tiến hành khử trùng: cho ethanol 70o vào cốc cho vừa ngập mẫu, lắc nhẹ (để mẫu không bị dập) khoảng 30 giây, rửa sạch bằng nước cất, tiếp tục cho dung dịch H2O2 3% vào cốc và ngâm trong khoảng từ 3 - 5 phút, sau đó rửa thật sạch bằng nước cất vô trùng (4 lần) để tẩy rửa hóa chất còn thừa.
Lấy nước rửa lần thứ 4 cấy trải lên môi trường PDA đặc ( Bảng 1) để xem có vi khuẩn xuất hiện hay không. Nếu có khuẩn lạc phát triển thì cần phải xử lý khử trùng triệt để hơn để loại bỏ vi sinh vật có trong đất.
Gắp khoảng 2g mẫu rễ (hoặc thân, hoặc lá) cho vào cối vô trùng giã nhuyễn rồi thêm 0,5 - 2ml nước cất vô trùng vào cối, để yên 10 phút, trộn và hút lấy phần dịch trích cho vào tube eppendorf 1,5 ml, để yên 10 phút cho dịch mẫu lắng xuống và hút 100µl phần trong cho vào 900µl nước cất ; có nghĩa là đã pha loãng 10 lần, tiến hành pha loãng 100, 10-1,10-2. Sau đó, hút 100µl dịch mẫu đã pha loãng cho vào môi trường NFb bán đặc (Bảng 3) trong ống nghiệm, đậy nắp lại cho vào tủ ủ, ủ ở 30oC. Sau 2 - 4 ngày, ta thấy xuất hiện vòng màu sáng (vòng pellicle), cách bề mặt môi trường 2 – 5mm (Tran Van Van et al., 1997), đó là chứng tỏ có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh.
Chuyển vi khuẩn từ môi trường bán đặc sang môi trường đặc: hút 50 µl từ lớp màng mỏng để lấy vi khuẩn trải lên bề mặt đĩa chứa môi trường PDA đặc, trải đều và đậy nắp lại cho vào tủ ủ, ủ ở 30o
C. Sau 2 - 3 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, nhỏ, tròn và phải nằm trên đường cấy cấy chuyển sang những đĩa khác cho tới khi quan sát dưới kính hiển vi thấy vi khuẩn đã ròng, chuyển mẫu đã ròng vào ống nghiệm chứa môi trường đặc trữ ở - 5o
C và được xem là một dòng vi khuẩn ròng.