CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn
4.1.1 Phân lập vi khuẩn
Từ rễ, thân, lá của cây Diếp cá thu được tại 2 xã thuộc tỉnh Kiên Giang đã phân lập được 15 dòng vi khuẩn trên môi trường PDA. Các dòng vi khuẩn này được phân bố ở cả trong rễ, thân, lá cây Diếp cá. Trong đó, 9 dòng phân lập từ lá chiếm tỷ lệ 60%, có 4 dòng phân lập từ rễ chiếm tỷ lệ 26,7% và 2 dòng phân lập từ thân chiếm tỷ lệ 13,3%. Chúng có đặc tính là sinh trưởng và phát triển trong môi trường vi hiếu khí. Khi được chủng trong môi trường NFb bán đặc và ủ trong thời gian 2 - 4 ngày, vi khuẩn phát triển thành vòng pellicle màu trắng đục cách mặt môi trường khoảng 0,2 - 0,5cm (Hình 5). Điều này đặc trưng cho sự phát triển của vi khuẩn nội sinh. Đồng thời chúng làm thay đổi màu môi trường ban đầu.
Hình 5 : Sự phát triển của vi khuẩn tạo thành vòng pellicle trong môi trường NFb bán đặc
Qua quá trình phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh từ rễ, thân, lá của cây Diếp cá ở tỉnh Kiên Giang đã thu được 15 dòng khác nhau được ký hiệu lần lượt là MR, MT, ML kèm theo thứ tự các dòng ( Bảng 8) .
Bảng 8 : Vị trí và địa điểm thu mẫu của các dòng vi khuẩn được phân lập từ cây Diếp cá trên môi trường PDA
STT Dòng vi khuẩn Vị trí phân lập Địa điểm thu mẫu
1 MR1 Rễ Xã Nam thái Sơn – Hòn Đất – Kiên Giang
2 MR2 Rễ Xã Nam thái Sơn – Hòn Đất – Kiên Giang
3 MR3 Rễ Xã Mỹ Thái – Hòn Đất – Kiên Giang
4 MR4 Rễ Xã Nam thái Sơn – Hòn Đất – Kiên Giang
5 MT1 Thân Xã Mỹ Thái – Hòn Đất – Kiên Giang
6 MT2 Thân Xã Mỹ Thái – Hòn Đất – Kiên Giang
7 ML1 Lá Xã Mỹ Thái – Hòn Đất – Kiên Giang
8 ML2 Lá Xã Mỹ Thái – Hòn Đất – Kiên Giang
9 ML3 Lá Xã Mỹ Thái – Hòn Đất – Kiên Giang
10 ML4 Lá Xã Nam thái Sơn – Hòn Đất – Kiên Giang
11 ML5 Lá Xã Nam thái Sơn – Hòn Đất – Kiên Giang
12 ML6 Lá Xã Mỹ Thái – Hòn Đất – Kiên Giang
13 ML7 Lá Xã Nam thái Sơn – Hòn Đất – Kiên Giang
14 ML8 Lá Xã Mỹ Thái – Hòn Đất – Kiên Giang
15 ML9 Lá Xã Nam thái Sơn – Hòn Đất – Kiên Giang
4.1.2 Đặc điểm khuẩn lạc
Sau khi cấy các dòng vi khuẩn đã ròng lên môi trường PDA trong đĩa petri, ủ ở 30oC từ 12 – 24 giờ. Kết quả quan sát cho thấy đa số các vi khuẩn phân lập được có dạng hình tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, trắng sữa, số còn lại có dạng bìa gợn sóng, răng cưa, độ nổi lài, màu trắng đục hay vàng, một số khuẩn lạc có dạng nhầy. Đặc điểm màu sắc, hình dạng khuẩn lạc được thể hiện ở Bảng 9 và Hình 6.
Bảng 9 : Đặc tính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA STT Dòng vi khuẩn Màu sắc Khuẩn lạc Hình dạng khuẩn lạc Đường kính khuẩn lạc(mm)
1 MR1 Trắng trong Tròn, bìa nguyên, mô 1,5
2 MR2 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, mô 1,5
3 MR3 Trắng đục Tròn, bìa răng cưa, mô 2,3
4 MR4 Trắng trong Tròn, bìa nguyên, mô 1,2
5 MT1 Trắng đục Tròn, bìa gợn sóng, lài 3
6 MT2 Trắng trong Tròn, bìa nguyên, lài 2,5
7 ML1 Trắng trong Tròn, bìa nguyên, mô 1
8 ML2 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, mô 2
9 ML3 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, mô 1,5
10 ML4 Trắng trong Tròn, bìa nguyên, mô 0,5
11 ML5 Vàng Tròn, bìa nguyên, mô 1,5
12 ML6 Trắng trong Tròn, bìa nguyên, mô 3,5
13 ML7 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, mô 2
14 ML8 Trắng trong Tròn, bìa nguyên, mô 3,5
15 ML9 Vàng Tròn, bìa nguyên, mô 1
Màu sắc khuẩn lạc : Phần lớn các khuẩn lạc của vi khuẩn có màu trắng trong gồm 7/15 dòng chiếm tỷ lệ 46,7% ; màu trắng đục gồm 6/15 dòng chiếm tỷ lệ 40% và màu vàng gồm 2/15 dòng chiếm tỷ lệ 13,3%.
Hình dạng khuẩn lạc : Đa số các dòng vi khuẩn có dạng hình tròn chiếm tỷ lệ 100%
Độ nổi khuẩn lạc : Phần lớn khuẩn lạc có độ nổi mô gồm 13/15 dòng chiếm tỷ lệ 86,7% ; các dòng có độ nổi lài 2/15 dòng chiếm tỷ lệ 13,3 %
Bìa khuẩn lạc : Phần lớn khuẩn lạc có bìa nguyên gồm 13/15 dòng chiếm tỷ lệ 86,6% ; dòng có bìa răng cưa gồm 1/15 dòng chiếm tỷ lệ 6,7% và 1/15 dòng có bìa
Kích thước khuẩn lạc : Đường kính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được dao động từ 0,5 – 4 mm sau khi cấy trên môi trường PDA và ủ ở 300
C trong 12 – 48 giờ.
Hình 6 : Một số khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA 4.1.3 Đặc điểm tế bào vi khuẩn
Quan sát hình thái và sự chuyển động của vi khuẩn được kiếm tra bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần cho thấy các dòng vi khuẩn :
Đa số các dòng vi khuẩn đều chuyển động gồm 14/15 dòng chiếm tỷ lệ 93,3% và 1/15 dòng không chuyển động chiếm tỷ lệ rất ít 6,7%.
Phần lớn các dòng vi khuẩn có dạng hình que ngắn gồm 10/15 dòng chiếm tỷ lệ 66,7%, dạng que dài gồm 4/15 chiếm tỷ lệ 26,7 % và có duy nhất 1/15 dòng có hình cầu đơn chiếm tỷ lệ rất ít 6,6%.
Dòng L4
Dòng MR2 Dòng ML6
Dòng L5
Dòng R4
Hình 7 : Vi khuẩn Gram âm (A) và vi khuẩn Gram dương (B) được chụp dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần
Bảng 10 :Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA STT Dòng vi khuẩn Gram * Hình dạng Chuyển động ** Kích thước vi khuẩn (mm)
Chiều dài Chiều rộng
1 MR1 - Que ngắn ++ 1,9 0,9 2 MR2 + Que ngắn ++ 1,8 0,8 3 MR3 - Que ngắn + 1,2 0,4 4 MR4 - Que ngắn ++ 1,5 0,8 5 MT1 - Que dài + 3 1 6 MT2 - Que ngắn ++ 0,7 0,5 7 ML1 - Cầu đơn ++ 0,6 0,6 8 ML2 + Que ngắn ++ 2,2 0,9 9 ML3 - Que ngắn - 1,9 0,8 10 ML4 - Que dài ++ 3 0,9 11 ML5 + Que dài ++ 3 1,1 12 ML6 - Que ngắn + 2,1 1 13 ML7 - Que dài ++ 3 1 14 ML8 - Que ngắn ++ 1,9 0,9 15 ML9 - Que ngắn ++ 1,3 0,5
(ghi chú : * : - Gram âm, + Gram dương ; ** : - không chuyển động, + chuyển động chậm, ++ chuyển động
A
4.2. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn
Tất cả 15 dòng vi khuẩn sau khi tiến hành khảo sát khả năng cố định đạm dựa vào lượng NH4+
(ammonium) do vi khuẩn sinh ra, kết quả cho thấy : tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp được ammonium. Ở ngày 2, các dòng vi khuẩn bắt đầu tạo ra lượng NH4+
(ammonium) với hàm lượng tương đối cao và giảm mạnh vào ngày thứ 4, sau đó tăng lên vào ngày thứ 6 sau khi chủng. Đây có thể là do ở ngày thứ 2, trong môi trường tăng sinh vi khuẩn ( PDA lỏng, bổ sung yeast extract 1g/l) có sẵn nguồn đạm nên lượng đạm vào ngày thứ 2 là tương đối cao. Đến ngày thứ 4 sau khi chủng, các dòng vi khuẩn sử dụng nguồn đạm có sẵn trong môi trường nên lượng NH4+ giảm đi rất nhiều. Đến ngày thứ 6 sau khi chủng, khi trong môi trường bắt đầu hết đạm thì lúc này các dòng vi khuẩn bắt đầu tổng hợp đạm cao và sinh ra lượng đạm cao hơn so với ngày 2.
4.2.1 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn nhóm 1 được phân
lập từ rễ, thân cây Diếp cá ( MR1 – MR4, MT1, MT2)
Ở ngày 2 sau khi chủng, tất cả 6 dòng vi khuẩn nhóm được phân lập từ rễ , thân đều tổng hợp được lượng ammonium tương đối cao. Tuy nhiên, do đặc tính mỗi dòng vi khuẩn khác nhau nên khả năng tổng hợp ammonium cũng rất khác nhau. Bên cạnh các dòng vi khuẩn tổng hợp lượng đạm trung bình tăng rất mạnh còn có một số dòng vi khuẩn tăng chậm sau khi chủng. Cao nhất là 2 dòng MR1 và MT1 với lượng ammonium sinh ra là (0,45 µg/ml) và (0,44 µg/ml) khác biệt không có ý nghĩa nhưng khác biệt ý nghĩa so với các dòng còn lại và dòng MT2 có khả năng tổng hợp đạm trung bình thấp nhất với lượng đạm sinh ra là 0,18 µg/ml.
Ở ngày thứ 4 sau khi chủng, hàm lượng đạm trung bình đều giảm đáng kể ở tất cả 6 dòng vi khuẩn nhóm. Cao nhất là lượng đạm trung bình do dòng MR3 tổng hợp được (0,22 µg/ml) khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại, những dòng còn lại có lượng đạm trung bình được sinh ra là tương đương nhau khác biệt không có ý nghĩa.
Ở ngày thứ 6 sau khi chủng, hàm lượng đạm trung bình do các dòng vi khuẩn tổng hợp được tăng cao thậm chí cao hơn so với ngày 2, cao nhất là hàm lượng đạm trung bình do 2 dòng MR3 và MR4 tổng hợp được (0,61 µg/ml và 0,60 µg/ml ) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại. Nhưng 2 dòng này tạo ra lượng đạm trung bình tương đương nhau. Chứng tỏ khả năng tổng hợp ammonium của 2 dòng
MR3 và MR4 là tương đương nhau. Thấp nhất là hàm lượng đạm trung bình do các dòng MT2 với hàm lượng đạm trung bình là 0,47 µg/ml .
Tóm lại, 6 dòng vi khuẩn nhóm được phân lập từ rễ, thân đều có khả năng tổng hợp được lượng ammonium nhất định. Dòng MR1 và MT1 tuy tạo ra lượng đạm trung bình vào ngày 2 cao nhất nhưng đến ngày 6 sau khi chủng hàm lượng đạm trung bình lại thấp hơn so với một số dòng còn lại. Đáng kể nhất là khả năng tổng hợp đạm trung bình của 2 dòng MR3 và MR4, mặc dù hàm lượng đạm trung bình vào ngày 2 và 4 đều thấp hơn so với các dòng còn lại nhưng đến ngày 6 sau khi chủng đều đạt lượng đạm cao nhất và tương đương nhau, khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại. Chứng tỏ dòng MR3 và MR4 là dòng triển vọng nhất trong tất cả các dòng vi khuẩn nhóm 1 được phân lập từ rễ, thân của cây Diếp cá (Bảng 11).
Bảng 11 : Lượng ammonium do các dòng vi khuẩn nhóm 1(MR1 – MR4, MT1, MT2) tổng hợp được theo thời gian (µg/ml)
STT Dòng vi khuẩn Đạm ngày 2 Đạm ngày 4 Đạm ngày 6
1 MR1 0,45a 0,09b 0,51bc 2 MR2 0,26b 0,07b 0,53b 3 MR3 0,28b 0,22a 0,61a 4 MR4 0,32b 0,11b 0,60a 5 MT1 0,44a 0,11b 0,54b 6 MT2 0,18c 0,08b 0,47c CV (%) 11,24 29,19 4,6
(*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%).
4.2.2 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn nhóm 2 được phân
lập từ lá cây Diếp cá ( ML1 – ML9)
Ở ngày thứ 2 sau khi chủng, tất cả 9 dòng vi khuẩn nhóm 2 được phân lập từ lá cây Diếp cá đều có khả năng tổng hợp được lượng ammonium tương đối cao. Cao nhất là dòng ML8 và ML2 với lượng đạm trung bình 0,57 µg/ml và 0,52 µg/ml khác biệt có ý nghĩa với các dòng còn lại. Thấp nhất là 3 dòng ML1, ML7, ML9 với lượng đạm trung bình sinh ra lần lượt là 0,32 µg/ml, 0,27 µg/ml và 0,33 µg/ml.
Đến ngày thứ 4 sau khi chủng, hàm lượng đạm trung bình của các dòng vi khuẩn nhóm 2 đa số đều giảm. Cao nhất vẫn là lượng đạm trung bình của dòng ML8
sinh ra với 0,27 µg/ml khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại. Dòng ML1 và ML6 có hàm lượng đạm trung bình thấp nhất (0 µg/ml và 0,01 µg/ml).
Hàm lượng đạm trung bình của các dòng vi khuẩn nhóm 2 tổng hợp được ở ngày thứ 6 sau khi chủng tăng cao thậm chí cao hơn so với ngày 2. Tuy nhiên, dòng ML4 và ML7 là 2 dòng có lượng đạm trung bình được tổng hợp tăng liên tục từ ngày 2 đến ngày 6 và là dòng có lượng đạm trung bình được tổng hợp cao nhất vào ngày 6 (0,73 µg/ml và 0,76 µg/ml) khác biệt không có ý nghĩa với nhau nhưng khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại. Điều này chứng tỏ 2 dòng ML4 và ML7 là 2 dòng triển vọng nhất trong tất cả các dòng vi khuẩn nhóm 2 được phân lập từ lá cây Diếp cá.
Bảng 12 : Lượng ammonium do các dòng vi khuẩn nhóm 2 (ML1 – ML9) tổng hợp được theo thời gian (µg/ml)
STT Dòng vi khuẩn Đạm ngày 2 Đạm ngày 4 Đạm ngày 6
1 ML1 0,32d 0,00c 0,50e 2 ML2 0,52ab 0,11b 0,66b 3 ML3 0,42c 0,03c 0,54de 4 ML4 0,44c 0,11b 0,73a 5 ML5 0,45bc 0,04b 0,61c 6 ML6 0,46bc 0,01c 0,56d 7 ML7 0,27d 0,13b 0,76a 8 ML8 0,57a 0,27a 0,62bc 9 ML9 0,33d 0,11b 0,61c CV (%) 9,84 28,76 4,44
(*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%).
4.2.3 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn triển vọng được phân lập từ rễ, thân, lá cây Diếp cá. phân lập từ rễ, thân, lá cây Diếp cá.
Khi so sánh khả năng tổng hợp ammonium của các dòng vi khuẩn triển vọng ở cả rễ, thân, lá của cây Diếp cá, kết quả là ở ngày thứ 2 hàm lượng đạm trung bình của 4 dòng vi khuẩn tạo ra tương đối cao và cao nhất là dòng ML4 tổng hợp được 0,44 µg/ml khác biệt có ý nghĩa so với 3 dòng còn lại.
Đến ngày thứ 4 sau khi chủng hàm lượng đạm trung bình của 4 dòng vi khuẩn này có xu hướng giảm đáng kể. Lượng đạm trung bình của dòng MR3 tổng hợp được cao nhất (0,22 µg/ml) khác biệt có ý nghĩa so với 3 dòng còn lại.
Ngày thứ 6 sau khi chủng hàm lượng đạm trung bình tăng lên rất mạnh. Đáng chú ý là 2 dòng ML4 và ML7 ở ngày thứ 2 và 4, hàm lượng đạm trung bình của 2 dòng này là rất thấp nhưng đến ngày thứ 6 sau khi chủng thì hàm lượng đạm trung bình tăng cao (0,73 µg/ml và 0,76 µg/ml) khác biệt không có ý nghĩa nhưng khác biệt có ý nghĩa so với 2 dòng còn lại. Điều này chứng tỏ 2 dòng ML4 và ML7 là 2 dòng triển vọng nhất trong tất cả các dòng vi khuẩn nhóm 1 và nhóm 2.
Hình 8 : Lượng NH4+ (µg/ml) trung bình do các dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra được phân lập từ rễ, thân, lá cây Diếp cá
(*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%).
Như vậy, tất cả 15 dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp ammonium, trong đó các dòng MR3, MR4, ML4, ML7 là triển vọng nhất. Các dòng vi khuẩn triển vọng này đã tạo lượng NH4+
cao nhất so với 15 dòng vi khuẩn đã được phân lập từ rễ, thân, lá cây Diếp cá. Những dòng vi khuẩn triển vọng có xu hướng tổng hợp đạm ở ngày 2, giảm dần ở ngày 4 và tiếp tục tăng mạnh hơn vào ngày 6. Lượng NH4+ sinh ra nhiều nhất ở Lá với dòng ML4 (0,73 µg/ml) và ML7 ( 0,76 µg/ml). Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Trúc (2013), các dòng vi khuẩn nội sinh T1, R4, L2 được phân
Thời gian (Ngày)
H àm lư ợn g N H4 + (µ g /m l)
lập từ cây Diếp cá ở Thành phố Cần Thơ có khả năng tổng hợp đạm tương đối cao dao động từ (0,490 µg/ml – 0,421 µg/ml). Theo Tô Hoàng Diễm (2013) dòng vi khuẩn nội sinh triển vọng nhất là dòng R6, T3, L4, L5, L6 tổng hợp được lượng đạm giao động từ 0,213 µg/ml - 0,221µg/ml được phân lập trong cây cúc mui. Qua đó cho thấy khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn nội sinh ở các cây khác nhau có thể khác