- KCl 2M - (NH4)2SO4 - Phenol nitroprusside - Sodium hypochloride. 3.1.4.8 Hóa chất thực hiện phản ứng PCR - Nước cất 2 lần đã khử trùng
- PCR buffer
- dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) - Taq polymerase
- DNA vi khuẩn
- Hóa chất dùng để thực hiện phản ứng điện di gel chứa sản phẩm phản ứng PCR: Agarose 1,2%, TBE buffer 1X, loading buffer, thang chuẩn PstI, ethidium bromide (EtBr). Bảng 6 : Thành phần các chất trong phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) Nước cất hai lần 11,75 Buffer 10X 2,5 MgCl2 2,0 Mồi xuôi 27F 0,25 Mồi ngược 1492R 0,25 dNTPs 4,0
Taq polymerase (5U/µl) 0,25
DMSO 0,5
DNA vi khuẩn 2,0
Tổng thể tích 25
3.2Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh Thu mẫu: Thu mẫu:
Hai mẫu Diếp cá được thu từ hai xã thuộc huyện Hòn Đất ở tỉnh Kiên Giang Dùng dao lấy toàn bộ( rễ, thân, lá) cây Diếp cá, bỏ vào bọc lylon và mang về phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật để xử lý mẫu và phân lập.
Lấy mẫu đất mang về phòng thí nghiệm vi sinh vật để đo độ pH của đất
Xử lý mẫu và phân lập
Rửa thật sạch đất bám ở rễ, thân và lá dưới vòi nước, để ráo nước
Khử trùng nước cất, bình tam giác (để đựng mẫu khử), eppendorf, đầu col xanh, col vàng, môi trường PDA, cối, chày. Việc khử trùng mẫu được thực hiện trong
Sau đó cắt rễ, thân và lá thành những đoạn nhỏ 2 – 3 cm (để riêng từng bộ phận) cho từng bộ phận mẫu vào cốc thủy tinh riêng biệt và tiến hành khử trùng: cho ethanol 70o vào cốc cho vừa ngập mẫu, lắc nhẹ (để mẫu không bị dập) khoảng 30 giây, rửa sạch bằng nước cất, tiếp tục cho dung dịch H2O2 3% vào cốc và ngâm trong khoảng từ 3 - 5 phút, sau đó rửa thật sạch bằng nước cất vô trùng (4 lần) để tẩy rửa hóa chất còn thừa.
Lấy nước rửa lần thứ 4 cấy trải lên môi trường PDA đặc ( Bảng 1) để xem có vi khuẩn xuất hiện hay không. Nếu có khuẩn lạc phát triển thì cần phải xử lý khử trùng triệt để hơn để loại bỏ vi sinh vật có trong đất.
Gắp khoảng 2g mẫu rễ (hoặc thân, hoặc lá) cho vào cối vô trùng giã nhuyễn rồi thêm 0,5 - 2ml nước cất vô trùng vào cối, để yên 10 phút, trộn và hút lấy phần dịch trích cho vào tube eppendorf 1,5 ml, để yên 10 phút cho dịch mẫu lắng xuống và hút 100µl phần trong cho vào 900µl nước cất ; có nghĩa là đã pha loãng 10 lần, tiến hành pha loãng 100, 10-1,10-2. Sau đó, hút 100µl dịch mẫu đã pha loãng cho vào môi trường NFb bán đặc (Bảng 3) trong ống nghiệm, đậy nắp lại cho vào tủ ủ, ủ ở 30oC. Sau 2 - 4 ngày, ta thấy xuất hiện vòng màu sáng (vòng pellicle), cách bề mặt môi trường 2 – 5mm (Tran Van Van et al., 1997), đó là chứng tỏ có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh.
Chuyển vi khuẩn từ môi trường bán đặc sang môi trường đặc: hút 50 µl từ lớp màng mỏng để lấy vi khuẩn trải lên bề mặt đĩa chứa môi trường PDA đặc, trải đều và đậy nắp lại cho vào tủ ủ, ủ ở 30o
C. Sau 2 - 3 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, nhỏ, tròn và phải nằm trên đường cấy cấy chuyển sang những đĩa khác cho tới khi quan sát dưới kính hiển vi thấy vi khuẩn đã ròng, chuyển mẫu đã ròng vào ống nghiệm chứa môi trường đặc trữ ở - 5o
C và được xem là một dòng vi khuẩn ròng.
3.2.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyên động của vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá trong cây Diếp cá
Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002).
Quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học: nhỏ 20µl nước cất vô trùng lên kính mang vật, dùng kim cấy đã được hơ nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội
lấy một ít mẫu vi khuẩn từ khuẩn lạc trải đều lên giọt nước, đậy kính đậy vật lại và quan sát ở độ phóng đại 400 lần, ghi nhận sự chuyển động của vi khuẩn (nếu có), quan sát và ghi nhận hình dạng.
Quan sát hình thái khuẩn lạc
Khi cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trường phân lập ta đồng thời tiến hành đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường. Tuy nhiên, đối với những khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ thì sử dụng kính lúp để quan sát.
Phương pháp đo kích thước vi khuẩn như sau:
Phương pháp đo kích thước vi khuẩn: đặt thước trắc vi vật kính (miếng kính đặc biệt dài 2 cm được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng 10 µm) vào bàn kính, chỉnh cho thấy rõ ảnh của thước. Dịch chuyển thước trắc vi vật kính và thước trắc vi thị kính (miếng kính tròn có khắc 100 vạch đặt giữa hai thấu kính của thị kính) sao cho 2 thước song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính sao cho 1 vạch của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và một vạch thứ 2 nào đó của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch khác của thước trắc vi thị kính. Đếm số khoảng của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính.
Trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính được tính theo công thức sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
m n
N
x 10
x: Trị số 1 khoảng cách của thước trắc vi thị kính N: Số khoảng cách của thước trắc vi vật kính n: Số khoảng cách của thước trắc vi thị kính Ta có:
- Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của vi mẫu. - Di chuyển vi mẫu sao cho một đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính, từ đó tìm một vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo.
- Đếm số khoảng cách thước trắc vi nằm trong hai vạch này.
- Tính kích thước vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng của hai thước nhân với trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp,
3.2.3 Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh
Sau khi quan sát và đo kích thước các tế bào vi khuẩn xong, tiến hành nhuộm Gram các vi khuẩn.
Trình tự nhuộm Gram được thực hiện như sau: - Lấy 10μl nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật.
- Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải ra cho đều và thật mỏng theo hình xoắn ốc trên kính mang vật
- Hơ mặt dưới của mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn cách khoảng 10cm nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật.
- Nhỏ từ 1 đến 2 giọt Crystal violet lên nơi cố định mẫu trải đều bằng que cấy và để 2 phút.
- Rửa bằng nước cất vô trùng từ 2 – 3 giây (để tránh trôi mẫu), chậm nhẹ cho khô nước.
- Nhỏ từ một đến hai giọt dung dịch Iod trải đều và để trong 1 phút. - Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
- Rửa lại bằng cồn 70° thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sau cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô. - Nhỏ từ một đến hai giọt Fushin trải đều và để 1 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của Fushin.
- Dùng giấy thấm chậm nhẹ hay hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho khô
- Quan sát mẫu trên kính hiển vi và ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của Fushin là mẫu Gram âm.
3.2.4 Xác định khả năng tổng hợp NH4+
Nguyên tắc:
Xác định nồng độ NH4+
nhờ phản ứng phenol và NH3 với sự hiện diện của tác nhân oxy hóa là hypochlorite hình thành có phức màu xanh, dưới pH kiềm. Sự hiện
diện của sodium nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng giữa NH3 với phenol và lên khoảng 10 lần (Page et al., 1982).
Hóa chất:
- Chuẩn bị dung dịch KCl2 M: Hòa tan 15 g KCl vào trong 100 ml nước cất.
- Stock (NH4+): Hòa tan 0,4717g (NH4)4SO4 vào 1 lít nước. Trữ dung dịch trong tủ lạnh. Trước khi sử dụng pha loãng 4 ml stock (NH4+) để được 200ml, sau cùng được dung dịch 2µg/ml
- Thuốc thử phenol nitroprusside: hòa tan 5g phenol và 0,025g nitroprusside trong nước được 0,5l.
- Hypochloride buffer: hòa tan 15ml NaOCl + 5g NaOH vào nước được 0,5l. - Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường NFb lỏng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành thí nghiệm:
- Cho 15ml môi trường lỏng NFb vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ướt 121°C trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần. - Nuôi cấy các dòng vi khuẩn trên máy lắc 200 vòng/phút
Phương pháp định lượng:
- Chuẩn bị thuốc thử phenol nitroprusside: cân chính xác 5g phenol và 0,025g nitroprusside hòa tan thêm nước cất vào đến 0,5l.
- Pha buffer: cho 15ml NaOCl có nồng độ (5 – 5,25%) và 5g NaOH vào 0,5l nước cất. - Pha đường chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 5 ppm:
Hình 3 : Sự thay đổi màu của dãy dung dịch NH4+
Đường chuẩn 0 ppm gồm có: 5ml H2O, 0ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử Đường chuẩn 1 ppm gồm có: 4ml H2O, 1ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử Đường chuẩn 2 ppm gồm có: 3ml H2O, 2ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử Đường chuẩn 3 ppm gồm có: 2ml H2O, 3ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử Đường chuẩn 4 ppm gồm có: 1ml H2O, 4ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử Đường chuẩn 5 ppm gồm có: 0ml H2O, 5ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử - Đo nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn:
+ Hút 1,5ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf. + Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
+ Hút 1ml dịch vi khuẩn đã ly tâm và 4ml H2O, 5ml buffer, 5ml thuốc thử. Tiến hành đo phổ OD.
+ Dựa vào sự thay đổi màu của phản ứng giữa thuốc thử và NH4+, đo OD ở bước sóng 636nm, sau đó vẽ đồ thị trên Excel có thể tính được nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn.
3.2.5 Xác định khả năng hòa tan lân
Dùng micropipette hút lần lượt 5µl dd vi khuẩn nội sinh từ mỗi ống nghiệm môi trường tăng sinh PDA lỏng có bổ sung yeast extract 1% nhỏ lên đĩa môi trường chứa lân khó tan (NBRIP) đặc (Bảng 2), mỗi đĩa 1 dòng, 3 lần lặp lại. Sau đó ủ ở 30o
C, theo dõi sự phát triển của chúng từ 1 - 2 ngày, dòng nào phát triển được trên môi trường NBRIP thì có khả năng hòa tan lân khó tan. Quan sát và đo đường kính vòng halo, khuẩn lạc mỗi ngày.
Hiệu quả hòa tan lân E được tính theo công thức:
E = 100 (C. Nguyen etal., 1992)
3.2.6 Xác định khả năng tổng hợp IAA
Chuẩn bị:
- Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường NFb lỏng.
- Cho 15ml môi trường lỏng NFb vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng Đường kính halo
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần.
- Nuôi cấy các dòng vi khuẩn trên máy lắc 200 vòng/phút. Trùm kín các ống nghiệm trong bọc nylon đen để tránh IAA tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng (vì chúng dễ bị phân hủy dưới ánh sáng)
Hóa chất:
- Thuốc thử: 4,5g FeCl3 trong 1 lít dd H2SO4 - Buffer
+ Dung dịch A2: 0,136g KH2PO4 trong 100ml nước cất. + Dung dịch B2: 0,174g K2HPO4 trong 100ml nước cất.
Phương pháp : Salkowski IAA (Glickmann và Dessaux, 1995)
- Lấy 39ml dung dịch A2, 61ml dung dịch B2 cho thêm nước cất vừa đủ 200ml, chỉnh pH = 7
- Hút 1,5ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf. - Ly tâm 5500 vòng/phút trong 10 phút.
- Hút cẩn thận 1ml phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào ống Durham.
- Ủ hỗn hợp trên trong tối 10 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn sau đó đo quang phổ OD ở bước sóng 530nm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chuẩn bị đường chuẩn IAA: Cân 0,0016g IAA thương mại hòa tan với 10ml phosphat buffer được nồng độ là 160µg/l. Sau đó pha loãng ra các nồng độ 0; 2,5; 5; 10; 20; 30; 40; 80 µg/ml.
Hình 4 : Sự thay đổi màu của dãy dung dịch IAA
- Kết quả đo phổ OD vẽ thành đường chuẩn IAA trên excel với trục tung là OD có giá trị từ 0 – 3. Trục hoành là nồng độ IAA có giá trị từ 0 – 80 µg/ml.
- Kết quả đo OD các dòng vi khuẩn phân lập được thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn, từ đó tính được nồng độ IAA đã được vi khuẩn tổng hợp
3.2.7 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của một số dòng vi khuẩn phân
lập
- Chuẩn bị môi trường PDA
- Hút 50µl dung dịch pha loãng của vi khuẩn gây bệnh (E. coli, A. hydrophila) trải lên bề mặt đĩa môi trường.
- Dùng giấy thấm đường kính 0,6 cm nhúng vào vi khuẩn nuôi đạt mật số 108 tế bào/ml trong vài phút và đặt giấy thấm lên bề mặt môi trường đã trải vi khuẩn gây bệnh. Theo phương pháp khuếch tán qua giấy lọc( Bauer etal, 1966)
- Ủ 30°C trong 12h – 24h. Quan sát khả năng tạo vòng kháng khuẩn. - Đo đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng sang 3 ngày liên tiếp. - Đường kính vòng vô khuẩn được tính bằng công thức:
Đường kính vòng vô khuẩn = đường kính vòng sáng – đường kính khuẩn lạc (D. Hernández et al., 2005)
3.2.8 Sử dụng kỹ thuật PCR nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh có triển vọng triển vọng
Sau khi kiểm tra khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn đã phân lập được, chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA cao nhất để thực hiện phản ứng PCR với mồi 16S - rRNA và so sánh với dữ liệu trên ngân hàng gene NCBI để định danh vi khuẩn.
Quy trình trích DNA từ khuẩn lạc của Trần Nhân Dũng (2011)
- Chọn 10 khuẩn lạc ròng, cho vào tuýp 2,2 ml (Ưu tiên chọn những khuẩn lạc lẻ, rời) - Cho 1 viên bi sắt vào tuýp và lắc bằng máy lắc.
- Cho vào 1 ml Lysis buffer, lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
- Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 5 phút, lấy phần dung dịch chuyển sang tuýp mới. - Cho một lượng tương đương Ethanol 95%, ly tâm 13000 rpm/5 phút, bỏ phần dung dịch phía trên.
- Rửa phần tủa bằng 500 µl Ethanol 70%, ly tâm 13000 rpm/5 phút. - Sấy khô chân không trong 10 phút (450C).
- Hòa tan trong 100 ul TE 0.1X. - Trữ ở -20oC..
Sau khi ly trích DNA từ các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá, phản ứng PCR gen 16S-rDNA(Lane, 1991) sử dụng đoạn mồi:
27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’
1492R 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’
Sau khi trích DNA các dòng vi khuẩn, sẽ tiến hành phản ứng PCR.
Bảng 7 : Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen của vi khuẩn nội sinh
Bước phản ứng Tên bước Số lượng chu kỳ Nhiệt độ ( o C) Thời gian 1 Biến tính 95 5 phút 2 Biến tính Gắn mồi Kéo dài 30 95 53 72 1 phút 30 giây 90 giây 3 Kéo dài 72 5 phút
Chuẩn bị gel agarose 1% với thể tích 40 ml. Cân 0,4g agarose cho vào chai nắp xanh. Đong 40 ml dung dịch TE 1X cho vào chai và lắc nhẹ cho agarose tan đều. Đặt chai vào lò vi sóng, đun khoảng 5 phút để cho agarose tan hoàn toàn và tạo thành dung dịch trong suốt. Lấy chai ra để nguội khoảng 55o - 60oC rồi bổ sung 0,8 μl Ethidium bromide, lắc nhẹ đều. Rót dung dịch vào góc dưới của khuôn gel đã được chuẩn bị, tránh tạo bọt khí. Để khoảng 45 phút cho gel nguội và đặc lại rồi lấy lược ra khỏi