Sau khi quan sát và đo kích thước các tế bào vi khuẩn xong, tiến hành nhuộm Gram các vi khuẩn.
Trình tự nhuộm Gram được thực hiện như sau: - Lấy 10μl nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật.
- Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải ra cho đều và thật mỏng theo hình xoắn ốc trên kính mang vật
- Hơ mặt dưới của mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn cách khoảng 10cm nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật.
- Nhỏ từ 1 đến 2 giọt Crystal violet lên nơi cố định mẫu trải đều bằng que cấy và để 2 phút.
- Rửa bằng nước cất vô trùng từ 2 – 3 giây (để tránh trôi mẫu), chậm nhẹ cho khô nước.
- Nhỏ từ một đến hai giọt dung dịch Iod trải đều và để trong 1 phút. - Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
- Rửa lại bằng cồn 70° thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sau cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô. - Nhỏ từ một đến hai giọt Fushin trải đều và để 1 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của Fushin.
- Dùng giấy thấm chậm nhẹ hay hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho khô
- Quan sát mẫu trên kính hiển vi và ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của Fushin là mẫu Gram âm.