2.6.2.1 Điện di trên gel agarose
Điện di trên gel agarose là kỹ thuật điện di để kiểm tra DNA sử dụng Agarose từ 0,3-2,0% làm bản gel, tùy theo kích thước của DNA. Nếu kích thước đoạn DNA nhỏ dưới 1kb, hàm lượng agarose sử dụng 1-2%, trong các phòng thí nghiệm thường sử dụng hàm lượng Agarose khoảng 0,7-0,8%.
2.6.2.2 Điện di trên gel polyacrylamide
Điện di trên gel polyacrylamide là kỹ thuật điện di để kiểm tra DNA hoặc protein, sử dụng bản polyacrylamide với nồng độ khoảng 3,5-20% làm bản gel, tùy theo kích thước đoạn DNA hoặc trọng lượng phân tử protein. Đoạn gel có kích thước càng nhỏ, protein có khối lượng phân tử nhỏ thì hàm lượng polyacrylamide sử dụng càng lớn, và ngược lại.
2.7Phương pháp giải trình tự DNA
2.7.1 Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy
Nguyên tắc cơ bản là dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA. DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotide không có nhóm 3,-OH phản ứng tổng hợp bị ngừng lại. Kết quả tạo ra các đoạn oligonucleotide dài ngắn khác nhau một nucleotide.
Thực hiện bốn phản ứng trong 4 ống eppendorf, mỗi ống có chứa DNA, mồi, bốn loại dNTP có một loại được đánh dấu phóng xạ (S35 – dATP, dGTP, dCTP, dTTP), enzyme và các điều kiện thích hợp. Ống A thêm 1% ddATP, ống G thêm 1% ddTTP, ống C thêm 1% ddCTP, ống T thêm 1% ddTTP. Sau khi khuếch đại DNA qua PCR khoảng 25-35 chu kỳ, điện di kết quả thu được trên gel polyacrylamide. Các đoạn oligonucleotide có kích thước khác nhau di chuyển với tốc độ khác nhau, tạo nên các vị trí khác nhau trên bản gel, thực hiện phản ứng hiện hình phóng xạ có thể quan sát được các đoạn mạch đơn DNA bằng các vạch trên bản gel. Tổng hợp kết quả phản ứng ở 4 ống thu được trình tự các nucleotide mạch đơn, có thể biết trình tự các nucleotide trong gen.
Tùy theo mục đích giữ mẫu, có thể sử dụng đồng vị phóng xạ S35 hoặc P32 đánh dấu phóng xạ đoạn mạch khuôn. Sử dụng S35
thời gian mất hoạt tính khoảng 3 tháng, còn P32 khoảng 14 ngày (Khuất Hữu Thanh, 2006).
2.7.2 Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động
Nguyên tắc chung: dựa trên cơ sở phương pháp dideoxy. Máy đọc trình tự cả trên hai mạch đơn nên có thể phát hiện và giảm các nhầm lẫn do kỹ thuật. Có hai loại mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng cho mỗi mạch đơn DNA. Tiến hành biến tính DNA trong môi trường có urea và nhiệt độ cao (khoảng 55oC), hai mạch đơn DNA tách rời nhau không bắt cặp lại với nhau.
Chùm tia laser đánh dấu vị trí và thời gian đi qua các nucleotide, từ đó tổng hợp được trình tự sắp xếp của gen (Khuất Hữu Thanh, 2006).
2.7.3 Phần mềm phân tích trình tự DNA được giải mã
Trong những năm gần đây lượng thông tin liên quan đến trình tự DNA được xác định ở các loài sinh vật khác nhau đã được quản lý dưới dạng ngân hàng dữ liệu (EMBL ở Châu Âu, GenBank ở Mỹ), có thể dễ dàng truy cập và tải về miễn phí thông tin trên internet.
BLAST là một trong những chương trình được sử dụng rộng rãi nhất trong tin sinh học. BLAST cho phép nhà nghiên cứu tìm kiếm DNA, protein xem đoạn mà ta quan tâm có tương cận với đoạn của sinh vật nào trong ngân hàng gen không, khi được cung cấp một thư viện hay dữ liệu các chuỗi đó. Để chạy BLAST cần đầu tư hai chuỗi: chuỗi đích và cơ sở dữ liệu chuỗi. Chuỗi đích nhỏ hơn nhiều so với cơ sở dữ liệu.
Có 5 chương trình BLAST: BLAST N, BLAST P, BLAST S, TBLAST N, TBLAST X, trong đó BLAST N (Nucleotide-Nucleotide BLAST) cho phép so sánh cấu trúc chuỗi nucleotide trong ngân hàng dữ liệu (Ken, 2002).
2.8Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2.8.1 Trong nước 2.8.1 Trong nước
Đến nay, Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu cây dược liệu nhưng phần lớn các nghiên cứu này chỉ tập trung khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cây dược liệu đặc biệt là Diếp cá thông qua các nghiên cứu điều trị lâm sàng. Khi canh tác cây dược liệu đa phần sử dụng phân bón hóa học hay phân bón hữu cơ. Tuy nhiên, việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật nội sinh hoặc sống ở vùng rễ cây dược liệu có khả năng kích thích cây phát triển tốt thông qua khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp hormone tăng trưởng kích thích cây dược liệu phát triển, góp phần giảm các loại bệnh, giảm chi phí sản xuất và đặc biệt là khả năng tổng hợp các hoạt chất kháng
khuẩn của chúng khi sống nội sinh với cây chưa đựợc quan tâm nhiều. Vì vậy, việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật hữu ích này để phát triển cây dược liệu có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả hơn sẽ mang nhiều ý nghĩa quan trọng trong giai đoạn hiện nay. Đỗ Tất Lợi (2006), Võ Văn Chi (2004) đã nghiên cứu rất cụ thể về hình thái và công dụng trị một số bệnh của cây Diếp Cá mà trong dân gian từ lâu đã sử dụng.
Phan Văn Cư và Nguyễn Thị Thu Hường (2012), đã chiết tách và định lượng sterols từ lá của cây Diếp Cá (Houttuynia cordata T..) ở Tỉnh Thừa Thiên Huế bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp.
Cây Diếp Cá chứa beta-caroten và lutein (Hà Thị Bích Ngọc, 2007).
2.8.2 Ngoài nước
Hiện nay, trên thế giới có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh trong cây dựợc liệu, đặc biệt là những cây dược liệu nhiệt đới như: cây Diếp cá (Houttuyniacordata T.), cây Sài đất (Wedeliachinensis M.), cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.)…
Bacilluscereus sống nội sinh có khả năng diệt các chủng E. coli, Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi và Klebsiella pneumonia
(Swetha Sunkar, C Valli Nachiyar, 2012)
Bacilluspolymyxa nội sinh trên cây Arabidopsisthaliana có khả năng tổng hợp
kháng sinh polymyxin kháng lại cả nấm và vi khuẩn (Salme Timmusk et al., 2005) Theo nghiên cứu của Artidtaya Bhoonobtong et al., (2012) trên cây Phyllodium
pulchellum, vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens sống nội sinh có khả năng diệt
E. coli, Pseudomonasaeruginosa.
Theo nghiên cứu của Sheng Qin et al., (2009). Đã phân lập đựợc một số dòng vi khuẩn nội sinh như: Streptomyces specialis trong rễ cây Sedum sp.
Pseudomonas alni trong lá cây Hoa môi (Callicarpa longifolia) cũng có khả năng
kháng khuẩn
Gon et al.., (2008) khi nghiên cứu công dụng của cây Diếp cá (Houttuynia
cordata T.) cho biết dịch chiết của cây này có khả năng diệt khuẩn Salmonella. Choi
Jee Young et al., (2010) cũng cho biết cây diếp cá có khả năng kháng khuẩn cũng như kháng viêm. Ngoài ra, các dịch chiết cây Diếp cá còn có thể giúp gia tăng số lựợng tế bào lympho nhanh chóng giúp tăng tính miễn dịch của người (Busarawan et al., 2007).
Tập đoàn vi sinh vật nội sinh hoặc sống ở vùng rễ cây trong đó có cây dựợc liệu có khả năng giúp cây tăng trưởng và đồng hóa tốt. Từ kết quả mới đây của nhóm nghiên cứu do Giáo sư Renato Fani phụ trách cho thấy, các vi khuẩn nội sinh với các cây trồng như Lavandula officinalis, Echinacea purperea và Echinacea angustifolia có thể sản xuất ra các hợp chất có tính kháng khuẩn gây các bệnh như Cysitic Fibrosis (CF).
Cây Diếp cá là một vị thuốc cổ truyền của Trung Quốc dùng để trị các bệnh nhiễm khuẩn. (http://www.wisegeek.com)
Theo Kim et al., (2008), cây Diếp cá có khả năng ức chế phát triển của vi khuẩn
E.coli O157- H7 giống như kháng sinh beta-lactam.
Theo Wangchauy và Chanpraser (2012) dịch chiết cây Diếp cá và hai chất Isoquercetin và Rutin có khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào bạch cầu vì vậy có thể sử dụng để điều trị bệnh ung thư máu.
CHƯƠNG 3
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1Phương tiện nghiên cứu:
3.1.1 Thời gian – địa điểm thực hiện
Thời gian: Tháng 7/2014 – 11/ 2014
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Phòng Thí nghiệm Sinh hóa, Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2 Vật liệu:
Toàn bộ rễ, thân và lá của cây Diếp Cá được thu thập ở một số xã thuộc huyện Hòn Đất tỉnh Kiên Giang
Chủng vi khuẩn E. Coli được cung cấp từ PTN Sinh học phân tử - Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học
Chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila được cung cấp từ bộ môn bệnh cá, Khoa thủy sản, trường Đại học Cần Thơ
3.1.3 Dụng cụ - thiết bị :
Sử dụng dụng cụ và thiết bị của phòng thí nghiệm Vi sinh vật có tại Viện nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ:
- Đĩa petri, ống nghiệm - Cối chày
- Eppendorf 2.0 ml, eppendorf 1.5ml - Ống đong 10ml, 100ml
- Cốc thủy tinh 10ml, 100ml, 200ml - Kẹp, kim cấy, que trải mẫu, đèn cồn - Lame, Lammelle – Duhan group (Đức). - Máy Vortex
- Tủ cấy vi sinh vật – Biosafe II – ESCO (Singapore). - Tủ ủ vi sinh vật – Binder (Đức).
- Kính hiển vi – Meji (Nhật); Trắc vi thị kính – Olympus (Nhật). - Nồi khử trùng nhiệt ướt – Pbinternational (Đức)
- Cân điện tử - Startorius (Đức) - pH kế - Hanna (Mỹ)
3.1.4 Hóa chất
3.1.4.1 Môi trường phân lập vi khuẩn nội sinh Bảng 1 : Môi trường PDA Bảng 1 : Môi trường PDA
Hóa chất Liều lượng (g/l)
Khoai tây 200
Dextrose 20
Agar 20
pH 6,5 ± 0,2
Thêm vừa đủ 1000ml nước cất
3.1.4.2 Môi trường khảo sát khả năng hòa tan lân Bảng 2 : Môi trường NBRIP đặc (Nautiyal, 1999) Bảng 2 : Môi trường NBRIP đặc (Nautiyal, 1999)
Hóa chất Liều lượng (g/l)
Đường ăn 10 MgSO4.7H2O 0,25 Ca3(PO4)2 5 MgCl2.6H2O 5 KCl 0,2 (NH4)2SO4 0,1
Bromthymol blue 0,5% trong KOH 0,2N 6ml
Agar 20
3.1.4.3 Môi trường khảo sát khả năng tổng hợp NH4Bảng 3 : Môi trường NFb (g/l) (Krieg và Dobereiner, 1984) Bảng 3 : Môi trường NFb (g/l) (Krieg và Dobereiner, 1984)
Hóa chất Liều lượng (g/l)
Acid malic 5 K2HPO4 0,5 MgSO4.7H2O 0,2 NaCl 0,1 CaCl2 0,02 KOH 4,5 Dung dịch vi lượng 2ml Dung dịch vitamin 1ml Dung dịch FeEDTA 1,64% 4ml
Bromthymol blue 0,5% KOH 0,2N 2ml
pH 6,8
Ghi chú : Đối với môi trường bán đặc bổ sung thêm 2g agar
Bảng 4 : Thành phần dung dịch vi lượng.
Hóa chất Liều lượng (g/l)
Na2MoO4.2H2O 1
MnSO4.H2O 1,5
H2BO3 1,4
CuSO4 0,4
ZnSO4.7H2O 0,12
Thêm nước cất vào cho đủ 1000ml
Bảng 5 : Thành phần dung dịch vitamin
Hóa chất Liều lượng (g/l)
Biotin 10
Pyridyoxyl – HCl 20
Thêm nước cất vào cho đủ 100ml
3.1.4.4 Hóa chất nhuộm Gram vi khuẩn
- Crystal violet, iod - Fushin,ethanol 70% - Nước cất 3.1.4.5 Hóa chất trích DNA - Ethanol 70% - Eppendorf 1,5ml và 2,0ml - Micropipet - Môi trường LB
- Dung dịch TE pH (8), SDS 10%, isopropanol, CTAB 10%/NaCl 0,7M - Proteinase K (20 mg/ml)
- Nước cất hai lần vô trùng, Chloroform: isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1).
Dung dịch TE gồm : 1% Triton X - 100, 1M Tris HCl - 8,5, 0,5 M EDTA - 8,0, nước cất vô trùng.
3.1.4.6 Hóa chất đo IAA:
- FeCl3 - H2SO4 - K2HPO4 - KH2PO4
- IAA thương mại
3.1.4.7 Hóa chất đo lượng đạm vi khuẩn cố định
- KCl 2M - (NH4)2SO4 - Phenol nitroprusside - Sodium hypochloride. 3.1.4.8 Hóa chất thực hiện phản ứng PCR - Nước cất 2 lần đã khử trùng
- PCR buffer
- dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) - Taq polymerase
- DNA vi khuẩn
- Hóa chất dùng để thực hiện phản ứng điện di gel chứa sản phẩm phản ứng PCR: Agarose 1,2%, TBE buffer 1X, loading buffer, thang chuẩn PstI, ethidium bromide (EtBr). Bảng 6 : Thành phần các chất trong phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) Nước cất hai lần 11,75 Buffer 10X 2,5 MgCl2 2,0 Mồi xuôi 27F 0,25 Mồi ngược 1492R 0,25 dNTPs 4,0
Taq polymerase (5U/µl) 0,25
DMSO 0,5
DNA vi khuẩn 2,0
Tổng thể tích 25
3.2Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh Thu mẫu: Thu mẫu:
Hai mẫu Diếp cá được thu từ hai xã thuộc huyện Hòn Đất ở tỉnh Kiên Giang Dùng dao lấy toàn bộ( rễ, thân, lá) cây Diếp cá, bỏ vào bọc lylon và mang về phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật để xử lý mẫu và phân lập.
Lấy mẫu đất mang về phòng thí nghiệm vi sinh vật để đo độ pH của đất
Xử lý mẫu và phân lập
Rửa thật sạch đất bám ở rễ, thân và lá dưới vòi nước, để ráo nước
Khử trùng nước cất, bình tam giác (để đựng mẫu khử), eppendorf, đầu col xanh, col vàng, môi trường PDA, cối, chày. Việc khử trùng mẫu được thực hiện trong
Sau đó cắt rễ, thân và lá thành những đoạn nhỏ 2 – 3 cm (để riêng từng bộ phận) cho từng bộ phận mẫu vào cốc thủy tinh riêng biệt và tiến hành khử trùng: cho ethanol 70o vào cốc cho vừa ngập mẫu, lắc nhẹ (để mẫu không bị dập) khoảng 30 giây, rửa sạch bằng nước cất, tiếp tục cho dung dịch H2O2 3% vào cốc và ngâm trong khoảng từ 3 - 5 phút, sau đó rửa thật sạch bằng nước cất vô trùng (4 lần) để tẩy rửa hóa chất còn thừa.
Lấy nước rửa lần thứ 4 cấy trải lên môi trường PDA đặc ( Bảng 1) để xem có vi khuẩn xuất hiện hay không. Nếu có khuẩn lạc phát triển thì cần phải xử lý khử trùng triệt để hơn để loại bỏ vi sinh vật có trong đất.
Gắp khoảng 2g mẫu rễ (hoặc thân, hoặc lá) cho vào cối vô trùng giã nhuyễn rồi thêm 0,5 - 2ml nước cất vô trùng vào cối, để yên 10 phút, trộn và hút lấy phần dịch trích cho vào tube eppendorf 1,5 ml, để yên 10 phút cho dịch mẫu lắng xuống và hút 100µl phần trong cho vào 900µl nước cất ; có nghĩa là đã pha loãng 10 lần, tiến hành pha loãng 100, 10-1,10-2. Sau đó, hút 100µl dịch mẫu đã pha loãng cho vào môi trường NFb bán đặc (Bảng 3) trong ống nghiệm, đậy nắp lại cho vào tủ ủ, ủ ở 30oC. Sau 2 - 4 ngày, ta thấy xuất hiện vòng màu sáng (vòng pellicle), cách bề mặt môi trường 2 – 5mm (Tran Van Van et al., 1997), đó là chứng tỏ có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh.
Chuyển vi khuẩn từ môi trường bán đặc sang môi trường đặc: hút 50 µl từ lớp màng mỏng để lấy vi khuẩn trải lên bề mặt đĩa chứa môi trường PDA đặc, trải đều và đậy nắp lại cho vào tủ ủ, ủ ở 30o
C. Sau 2 - 3 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, nhỏ, tròn và phải nằm trên đường cấy cấy chuyển sang những đĩa khác cho tới khi quan sát dưới kính hiển vi thấy vi khuẩn đã ròng, chuyển mẫu đã ròng vào ống nghiệm chứa môi trường đặc trữ ở - 5o
C và được xem là một dòng vi khuẩn ròng.
3.2.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyên động của vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá trong cây Diếp cá
Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002).
Quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học: nhỏ 20µl nước cất vô trùng lên kính mang vật, dùng kim cấy đã được hơ nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội
lấy một ít mẫu vi khuẩn từ khuẩn lạc trải đều lên giọt nước, đậy kính đậy vật lại và quan sát ở độ phóng đại 400 lần, ghi nhận sự chuyển động của vi khuẩn (nếu có), quan sát và ghi nhận hình dạng.
Quan sát hình thái khuẩn lạc
Khi cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trường phân lập ta đồng thời tiến hành đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường. Tuy nhiên, đối với những khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ thì sử dụng kính lúp để quan sát.
Phương pháp đo kích thước vi khuẩn như sau:
Phương pháp đo kích thước vi khuẩn: đặt thước trắc vi vật kính (miếng kính đặc biệt dài 2 cm được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng 10 µm) vào bàn kính, chỉnh cho thấy rõ ảnh của thước. Dịch chuyển thước trắc vi vật kính và thước trắc vi thị kính (miếng kính tròn có khắc 100 vạch đặt giữa hai thấu kính của thị kính) sao cho 2 thước song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính sao cho 1 vạch của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và một vạch thứ 2 nào đó của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch khác của thước trắc vi thị kính.