Chuẩn bị:
- Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường NFb lỏng.
- Cho 15ml môi trường lỏng NFb vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng Đường kính halo
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần.
- Nuôi cấy các dòng vi khuẩn trên máy lắc 200 vòng/phút. Trùm kín các ống nghiệm trong bọc nylon đen để tránh IAA tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng (vì chúng dễ bị phân hủy dưới ánh sáng)
Hóa chất:
- Thuốc thử: 4,5g FeCl3 trong 1 lít dd H2SO4 - Buffer
+ Dung dịch A2: 0,136g KH2PO4 trong 100ml nước cất. + Dung dịch B2: 0,174g K2HPO4 trong 100ml nước cất.
Phương pháp : Salkowski IAA (Glickmann và Dessaux, 1995)
- Lấy 39ml dung dịch A2, 61ml dung dịch B2 cho thêm nước cất vừa đủ 200ml, chỉnh pH = 7
- Hút 1,5ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf. - Ly tâm 5500 vòng/phút trong 10 phút.
- Hút cẩn thận 1ml phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào ống Durham.
- Ủ hỗn hợp trên trong tối 10 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn sau đó đo quang phổ OD ở bước sóng 530nm.
- Chuẩn bị đường chuẩn IAA: Cân 0,0016g IAA thương mại hòa tan với 10ml phosphat buffer được nồng độ là 160µg/l. Sau đó pha loãng ra các nồng độ 0; 2,5; 5; 10; 20; 30; 40; 80 µg/ml.
Hình 4 : Sự thay đổi màu của dãy dung dịch IAA
- Kết quả đo phổ OD vẽ thành đường chuẩn IAA trên excel với trục tung là OD có giá trị từ 0 – 3. Trục hoành là nồng độ IAA có giá trị từ 0 – 80 µg/ml.
- Kết quả đo OD các dòng vi khuẩn phân lập được thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn, từ đó tính được nồng độ IAA đã được vi khuẩn tổng hợp