4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.5.2 Kết quả chất lượng phôi bò sau giải đông
Sau khi bảo quản trong nitơ lỏng một tuần, chúng tôi tiến hành giải đông để đánh giá chất lượng phôi sau đông lạnh. Giải đông là quá trình ngược lại của đông lạnh, đưa phôi đang ở trạng thái tiềm sinh lạnh trở lại nhiệt độ
37oC. Chúng tôi tiến hành đông lạnh trên nguồn phôi bò tạo ra trong ống nghiệm theo ba phương pháp:
Đông lạnh một bước với chất bảo vệ lạnh là Ethylen glycol Đông lạnh ba bước với chất bảo vệ lạnh là Glycerol
Đông lạnh theo phương pháp thuỷ tinh hoá
Do vậy khi giải đông cũng theo ba phương pháp tương ứng với ba phương pháp đông lạnh
* Đối với các phôi đông lạnh bằng Ethylene glycol được giải đông theo phương pháp một bước với quy trình của Nhật Bản. Ưu điểm của phương pháp này là: phôi sau khi giải đông có thể cấy ngay cho bò nhận trong vòng 15 phút, không cần môi trường giải đông, không cần kính hiển vi, có thể thao tác như kỹ thuật thụ tinh nhân tạo cho bò.
* Đối với các phôi được đông lạnh bằng chất bảo vệ lạnh là Glycerol, các phôi này được giải đông theo phương pháp ba bước của Australia, phương pháp này có ưu điểm là biết chính xác tỷ lệ sống sót cũng như chất lượng phôi sau giải đông. Nhưng cũng có những khó khăn khi áp dụng vào thực tế sản xuất: đòi hỏi phải có kính hiển vi, môi trường giải đông và các dụng cụ khác.
* Đông lạnh bằng phương pháp thuỷ tinh hoá mới được nghiên cứu ở
Việt Nam, ưu điểm của phương pháp này là không cần dung dịch giải đông, không cần sử dụng kính hiển vi tuy nhiên với phương pháp này lại không đánh giá được chất lượng phôi trước khi cấy cho bò nhận.
Sau khi đông lạnh-giải đông, dưới tác động của chất bảo vệ lạnh, tốc độ
đông lạnh, môi trường đông lạnh và giải đông đã có ảnh hưởng tới chất lượng phôi. Kết quả đánh giá chất lượng phôi sau đông lạnh-giải đông được trình bày qua bảng 4.14.
Bảng 4.14. Kết quả đánh giá chất lượng phôi sau giải đông
Kết quả
Chỉ tiêu theo dõi
n %
Phôi đông lạnh-giải đông 291 100
Phôi loại A 122 41,92
Phôi loại B 90 30,93
Phôi loại C 79 27,15
Phôi đông lạnh-giải đông là 291, trong đó có :
122 phôi dâu và phôi nang loại A chiếm tỷ lệ 41,92% Phôi dâu và phôi nang loại B là 90 đạt tỷ lệ 30,93% Phôi loại C là 79 chiếm 27,15%.
Như vậy sau đông lạnh-giải đông đã có một số phôi loại A chuyển thành phôi loại B hoặc C, đồng thời một số phôi loại B chuyển thành phôi loại C (phôi kém chất lượng hoặc chết). Tỷ lệ phôi dâu và phôi nang loại A thu được là cao nhất điều này chứng tỏ việc sử dụng phôi dâu và phôi nang loại A để đông lạnh sẽ thu được phôi sau giải đông có chất lượng đảm bảo. Như
vậy tỷ lệ phôi đảm bảo chất lượng đạt 72,85% (gồm phôi loại A và B). Kết quả này không có sự sai khác nhiều so với các tác giả khác đã công bố :
Theo Leibo (1982)[45], Renard và cs (1982)[56] cho biết tỷ lệ phôi sống sau giải đông đạt trên 80%. Theo kết quả nghiên cứu của Miyamoto, Ishibashi (1987)[50] tỷ lệ phôi sống sau giải đông là 80%. Theo Trounson và cs (1982)[66] thì tỷ lệ sống sau giải đông là 84,40% ; còn theo Chupin và Procureur (1982)[27] tỷ lệ phôi sống sau giải đông là 90% và tỷ lệ phôi nang sống sau giải đông là 96,10%.Theo Sang Runzi và cs (1996)[58], tỷ lệ phôi sống sau giải đông đạt 76,20%, trong đó tỷ lệ phôi nang sống đạt 81,80% còn phôi dâu là 77,40% ; phôi loại A đạt tỷ lệ sống 91%, phôi loại B đạt tỷ lệ sống 63,30%.
Có nhiều ý kiến khác nhau về sự ảnh hưởng của giai đoạn phát triển của phôi đến tỷ lệ sống sau giải đông. Những nghiên cứu trên phôi chuột từ
16 tế bào cho đến phôi nang đông lạnh ở -196oC của Whittingham (1972)[67] và Willadsen (1980)[68] đã làm cơ sở ban đầu để nghiên cứu ứng dụng ở các loài gia súc khác.
Phôi bò ở giai đoạn 8-16 tế bào (Wilmuts và cs (1992)[71]) và 16-32 tế bào (Trouson và cs(1976)[64]), giảm sức sống ở 0oC trong khi ở giai đoạn phát triển cao hơn – phôi nang thì ở 0oC duy trì được 2 ngày (Trouson và cs (1980)[65]; Bon Durant và cs(1982)[20]). Niemann và Nienhaus (1982)[52] nhận thấy rằng kỹ thuật đông lạnh nhanh thì kết quả phôi ở 8 ngày tuổi tốt hơn so với phôi ở 7 ngày tuổi. Seidel và cs (1983)[61] cũng nhận xét rằng tỷ lệ sống của phôi nang cao hơn của phôi dâu. Còn theo Sang Runzi và cs (1996)[58] lại cho rằng sử dụng phôi dâu và phôi nang để đông lạnh thì tỷ
lệ sống sau đông lạnh-giải đông là như nhau.
Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh
Trong khuôn khổ đề tài chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của ba phương pháp đông lạnh tới chất lượng phôi sau đông lạnh. Kết quả được trình bày qua bảng 4.15.
Bảng 4.15. Ảnh hưởng của các phương pháp đông lạnh đến chất lượng phôi khi giải đông
Chất lượng phôi trước
đông lạnh Chất lượng phôi sau giải đông
Loại A Loại B Loại A Loại B Loại C
Phương pháp
đông lạnh phôi n
n (%) n (%) n (% ± SE) n (% ± SE) n (% ± SE)
Ba bước 95 48 50,53 47 49,47 40 41,24 ± 0,32 27 28,33 ± 0,22 28 30,43 ± 0,61
Một bước 90 54 60 36 40 47 52,51 ± 1,02 25 26,78 ± 0,13 18 20,71 ± 0,43
Sau quá trình đông lạnh-giải đông chúng tôi nhận thấy rằng có một số
lượng phôi giảm chất lượng từ loại A xuống loại B hoặc C, từ loại B xuống loại C. Cụ thể như sau :
Phương pháp đông lạnh ba bước: trước đông lạnh số phôi loại A là 48 chiếm 50,53% còn số phôi loại B là 47 chiếm 49,47%. Sau đông lạnh, tỷ lệ
phôi loại A còn lại là 41,24% và tỷ lệ phôi loại B là 28,33% và xuất hiện 30,43% phôi loại C, đây là những phôi có chất lượng thấp hoặc phôi đã chết.
Phương pháp đông lạnh một bước: trước đông lạnh tỷ lệ phôi loại A là 60% và phôi loại B là 40%, tuy nhiên sau quá trình đông lạnh và giải đông tỷ
lệ phôi loại A, B giảm xuống chỉ còn lần lượt là 52,51% và 26,78% ; xuất hiện 20,71% phôi loại C.
Phương pháp đông lạnh thuỷ tinh hoá: có 45,28% phôi loại A và 54,72% phôi loại B trước đông lạnh nhưng sau tác động của quá trình đông lạnh-giải đông tỷ lệ phôi loại A và B giảm xuống chỉ còn tương ứng là 33,22% và 35,92% xuất hiện 30,86% phôi loại C.
Nhìn chung cả ba phương pháp đều cho kết quả phôi loại A và B khá cao, tỷ lệ phôi thoái hoá và chết thấp. Tuy nhiên tỷ lệ này ở mỗi phương pháp là khác nhau, sở dĩ như vậy là ở mỗi phương pháp đều có những nhược điểm khó khăn trong quá trình tiến hành.
Với phương pháp dông lạnh ba bước, tỷ lệ phôi kém chất lượng và chết chiếm tỷ lệ 30,43%. Để lý giải điều này ta xét đến kỹ thuật đông lạnh. Khi đưa phôi vào cân bằng với chất bảo vệ lạnh ở phương pháp này, với mỗi bước chúng tôi phải lưu phôi trong 5 phút. Tức là mỗi phôi phải trải qua 15 phút cân bằng. Trên thực tế nếu cân bằng riêng rẽ từng phôi một thì tốn rất nhiều thời gian. Vì vậy chúng tôi tiến hành xen kẽ tức là khi đưa phôi thứ nhất vào môi trường được khoảng 3 phút chúng tôi đưa phôi thứ hai vào. Khi phôi thứ
hai lưu được 2 phút chúng tôi đưa tiếp phôi thứ ba vào. Khi đủ 5 phút chúng tôi chuyển phôi thứ nhất sang bước tiếp theo. Cứ như vậy cân bằng đến phôi
cuối cùng. Quá trình cân bằng như vậy không tránh khỏi một số sai sót, phôi lưu chưa đủ thời gian cân bằng đã chuyển sang bước tiếp theo chính vì vậy không đảm bảo yêu cầu kỹ thuật làm cho sức sống của phôi giảm thậm chí thoái hoá hoặc chết phôi.
Phương pháp đông lạnh một bước: Tỷ lệ phôi loại C là 20,71%. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến thoái hoá hoặc chết phôi nhưng nguyên nhân chính là do Ethylen glycol rất độc cho tế bào. Nếu ở môi trường đông lạnh thì ít ảnh hưởng nhưng trong điều kiện phòng nếu thao tác không nhanh sẽ dẫn đến hiện tượng chết phôi. Ở phương pháp này tỷ lệ phôi loại C thấp hơn cả
bởi vì quá trình cân bằng phôi diễn ra một bước nên ít xảy ra sai sót.
Phương pháp thỷ tinh hoá: Phương pháp này đòi hỏi trình độ kỹ thuật kinh nghiệm cao, thao tác nhanh chính xác do thời gian cân bằng tính từ khi chuyển vào môi trường thuỷ tinh hoá V1, V2, V3 đến khi nạp phôi vào cọng rạ không quá một phút. Trên thực tế trong quá trình cân bằng không tránh khỏi những sai sót dẫn đến chất lượng phôi bịảnh hưởng.
Ba phương pháp đông lạnh và giải đông đều cho kết quả phôi có khả
năng nuôi cấy cao, trong đó phương pháp thuỷ tinh thể là phương pháp mới được nghiên cứu trong những năm gần đây song kết quả cũng rất khả quan. Đồng thời phương pháp này có những ưu điểm không đòi hỏi nhiều trang thiết bị máy móc, thời gian đông lạnh-giải đông nhanh, dễ thực hiện ở cơ sở tuy nhiên đòi hỏi kỹ thuật viên có trình độ kỹ thuật cao. Nếu đáp ứng được yêu cầu này thì đông lạnh phôi bò bằng phương pháp thuỷ hoá sẽ rất khả thi để ứng dụng vào thực tế.