3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.3.4 Nuôi hợp tử trong ống nghiệm
Sau khi thụ tinh xong các hợp tử giả định được nuôi trong môi trường TCM-199 có bổ sung 5% huyết thanh bê và kháng sinh (100.000UI Penicinllin/ml và 100µg Streptomycin/ml) hay CR1aa có bổ sung thêm 20µl axat amin không thay thế, 10µl/ml axit amin thay thế, 1mg/ml L-glutamic, 3mg/ml BSA, 5% huyết thanh bê và kháng sinh trong đĩa vô trùng và việc nuôi cấy được duy trì ở nhiệt độ 38,5oC trong điều kiện 5% CO2 với độẩm tối đa.
Sự phân chia của hợp tử được đánh giá dựa vào sự phân chia tế bào 48 giờ sau khi thụ tinh. Sự phát triển của phôi được đánh giá bằng kính hiển vi soi nổi ở ngày thứ 5, 6, 7 sau khi nuôi cấy trong ống nghiệm dựa vào số phôi (tỷ lệ) phát triển đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang.
Đánh giá phân loại phôi. Áp dụng phương pháp đánh giá phân loại phôi đựa trên các đặc điểm sau:
Hình thái chung của phôi: phôi có hình dáng và cấu tạo như hình cầu, được bao bọc xung quanh bởi màng trong suốt. Kích thước từ 100-200µm.
Mức độ phân chia tế bào: thường phụ thuộc vào giai đoạn phát triển đầu tiên là 2, 4, 8, 16…, phôi dâu, phôi nang; độ tập chung, phân tán và mối liên kết của các tế bào phôi.
Màu sắc của tế bào: màu sắc có liên quan đến mức độ sống chết hay thoái hoá của các tế bào; mức độ phân tán hoặc tập trung của mầm phôi; mức độ tổn thương và mảnh vụn vỡ của tế bào….
Từ các cơ sở trên, 7 ngày sau khi thụ tinh phôi được phân loại theo các bước sau:
Phôi sau khi thu hoạch loại bỏ trứng không thụ tinh. Trứng không thụ
tinh màng noãn hoàng hiện rõ nét, nhân có cấu trúc đồng nhất không có sự
phân chia.
Trứng thụ tinh: có sự phân chia tế bào và tương ứng với giai đoạn phát triển của phôi.
Phôi kém chất lượng là những phôi chậm phát triển, phôi thoái hoá. Phôi chất lượng tốt: là những phôi dâu, phôi nang có hình dáng và kích thước phù hợp với tuổi phôi, màu sắc của tế bào đặc trưng.
Những phôi đạt tiêu chuẩn: phôi dâu, phôi nang loại A,B mới được sử dụng để đông lạnh.