Sóng nang và tính trội của nang: Trứng rụng từ
2.9.2Những chất bảo vệ sinh học lạnh thông dụng
Phôi chỉ sống sót khi người ta bổ sung một dung môi hữu cơ hay còn gọi là chất bảo vệ sinh học lạnh vào môi trường huyền phù để đông lạnh. Các chất thường được sử dụng là: glycerol, dimethysufoxide (DMSO) và một số
glycol (ethylen glycol, propylen glycol…) trong đó glycol là chất bảo vệ sinh học lạnh được sử dụng phổ biến trên nhiều loài động vật và có hiệu quả cao nhất. Glycerol có phân tử lượng 92, có độc tính nhẹ, có tác dụng như một chất chống đông, có khả năng thẩm thấu cao qua màng tế bào, hoà tan trong nước và cồn. Trong quá trình cân bằng, glycerol xâm nhập vào bên trong tế
bào làm cho tế bào không bị giảm dung tích. Khi vào bên trong tế bào, các phân tử glycerol nằm xen kẽ với các phân tử nước, nên đóng băng ở dạng nhỏ, loại trừ được sự giãn nở của phân tử nước có kích thước lớn hơn, ngăn cản được sự phá vỡ màng tế bào. Vì vậy mà glycerol giữ được sựổn định về nồng độ các chất hoà tan, không làm thay đổi áp suất thẩm thấu và hạn chế sự phá huỷ protein của tế bào trong quá trình đông lạnh. Để phôi có thể cân bằng với glycerol, người ta chuyển phôi vào dung dịch PBS có nồng độ glycerol tăng dần trong một khoảng thời gian nhất định để thực hiện rút nước nội bào và
thay thế bằng glycerol. Điều quan trọng nhất là thời gian và nồng độ thích hợp để ngâm phôi, điều này phụ thuộc vào phôi của mỗi loài động vật và trạng thái phát triển của phôi.
Năm 1977, Bilton và cs [18] đã sử dụng glycerol nồng độ 1,4M thu được phôi bò có sức sống cao khi đông lạnh với tốc độ -0,3oC/phút đến -30oC hoặc -35oC sau đó bảo quản phôi trong nitơ lỏng -196oC. Renard và cs (1982)[56] đã cân bằng sáu bước với nồng độ glycerol ở mỗi bước là 0,25M; 0,5M; 0,75M; 1M; 1,25M và 1,5M cách nhau 10 phút và giữ phôi ở nồng độ
cuối cùng.
Có thể thay thế Glycerol bằng Ethylene glycol, có phân tử lượng thấp hơn (62,07), chất này tương tự như glycerol nhưng thời gian ngâm phôi bò ngắn hơn. Ưu điểm của việc dùng ethylene glycol trong đông lạnh phôi bò là khi giải đông không cần rút chất này ra khỏi phôi theo các bước mà nó tự
thẩm xuất ra khỏi tế bào, vì vậy người ta có thể cấy phôi ngay được. Điều cần lưu ý là Ethylene glycol rất độc cho phôi do đó phải thận trọng khi sử dụng.
Hasler và cs (1997)[37] đã đông lạnh phôi bò tạo ra trong ống nghiệm trong dung dịch PBS có nồng độ 1,4M glycerol hay 1,5M ethylene glycol. Sau khi giải đông và nuôi 72 giờ, tỷ lệ phôi thoát màng tương ứng là 69,20% và 62,40%.
Dimethylsulfoxide (DMSO) cũng là chất bảo vệ lạnh có phân tử lượng thấp (78,13). Chất này đầu tiên được Wilmut và Rowson (1973)[69] sử dụng để
đông lạnh phôi bò. Tuy nhiên, nhiều tác giả nhận thấy rằng, có sự khác nhau về
khả năng thẩm thấu của chất bảo vệ lạnh giữa phôi của các loài và đối với phôi bò thì glycerol có khả năng thẩm thấu tốt hơn DMSO. Vì thế đến cuối những năm 1970, glycerol được dùng nhiều hơn DMSO trong việc đông lạnh phôi bò.
Đường (sucrose, lactose) và protein (bovine serum albumin, hyaluronic acid) cũng được dùng như những chất bảo vệ lạnh nhưng chúng thường được dùng với các chất bảo vệ lạnh khác. Các phòng thí nghiệm trên thế giới có thể
sử dụng một chất bảo vệ lạnh duy nhất hoặc kết hợp nhiều chất bảo vệ lạnh như dimethy sulphoside, acetamide, propylen glycol, glycerol, ethylene glycol,
polyethylene glycol, BSA, sucrose, trehalose và glucose với các nồng độ khác nhau để đông lạnh phôi động vật có vú.
Theo Bùi Xuân Nguyên (1997)[22], việc sử dụng các chất bảo vệ lạnh và khả năng sống của phôi đông lạnh có sự khác nhau giữa các loài. Đối với thỏ, khả năng sống của phôi đông lạnh trong hỗn hợp sucrose và glyceorol hay DMSO là rất thấp (0-5%) so với đông lạnh bằng propaneol (92%). Đối với phôi dâu - phôi nang bò, sử dụng chất bảo vệ lạnh propaneol tốt hơn so với sử dụng glycerol (75% so với 0%). Trong khi đó phôi bò được đông lạnh trong hỗn hợp bảo vệ lạnh sucrose-propaneol-glycerol có tỷ lệ sống cao hơn so với hỗn hợp sucrose-propaneol (65% so với 0%). Sự khác biệt về khả năng sống của phôi khi sử dụng các chất bảo vệ lạnh khác nhau giữa các loài khác nhau vẫn chưa được làm rõ.