3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.3.5Đông lạnh và giải đông phôi bò
Phôi đủ tiêu chuẩn được đông lạnh theo các phương pháp: đông lạnh chậm một bước bằng Ethylen glycol, đông lạnh chậm 3 bước bằng Glycerol và thuỷ tinh hoá (Vitrification).
Đông lạnh 3 bước
Trong phương pháp này chúng tôi dùng Glycerol làm chất bảo vệ lạnh. Bổ sung chất bảo vệ lạnh cho phôi trước khi đông lạnh bằng cách cho phôi cân bằng với dung dịch Glycerol với nồng độ tăng dần.
Chuẩn bị dung dịch đông lạnh
Dung dịch thứ nhất:DPBS : DPBS + 0,4% BSA + 20% CS. Dung dịch thứ hai: 3% Glycerol trong môi trường DPBS Dung dịch thứ ba: 6% Glycerol trong môi trường DPBS Dung dịch thứ tư: 10% Glycerol trong môi trường DPBS
Đông lạnh trên máy đông lạnh tự động CL-2000:
Đầu tiên rửa phôi thu được bằng dung dịch thứ nhất ít nhất 3 lần trong 3 đĩa petri vô trùng. Sau đó chuyển phôi theo thứ tự vào dung dịch thứ 2, 3 và 4. Trong mỗi dung dịch, phôi được lưu lại 5 phút để cân bằng. Sau đó hút phôi vào cọng rạ, hàn cọng rạ và để cân bằng ở nhiệt độ phòng 10 phút rồi đưa vào máy đông lạnh đã được khởi động trước và đang ở nhiệt độ -7oC. Sau 2 phút tạo đá trên cọng rạ bằng panh làm lạnh bằng nitơ lỏng và cọng rạ chứa phôi được duy trì ở nhiệt độ đó thêm 8 phút nữa. Nhiệt độ sau đó được hạ tự
động với tốc độ -0,3oC/phút đến nhiệt độ -32oC thì dừng lại. Lúc này quá trình đông lạnh đã kết thúc, lấy cọng rạ chứa phôi ra khỏi máy đông lạnh và chuyển phôi vào hộp xốp chứa nitơ lỏng -196oC để bảo quản lâu dài.
Giải đông phôi sau khi đông lạnh
Chuẩn bị các dung dịch giải đông:
Dung dịch 1: 6% Glycerol + 0,3M Sucrose trong môi trường DPBS Dung dịch 2: 3% Glycerol + 0,3M Sucrose trong môi trường DPBS Dung dịch 3: 0,3M Sucrose trong môi trường DPBS
Sau khi lấy cọng rạ ra khỏi nitơ lỏng, giữ trong không khí 6 giây rồi thả
khô cọng rạ bằng bông tẩm cồn 90o. Cắt cọng rạ phía đầu đối diện nút chặn bông để phôi cùng với dung dịch trong cọng rạ chảy vào đĩa petri vô trùng. Soi tìm phôi dưới kính hiển vi soi nổi, hút chuyển phôi tìm được vào thứ tự
các dung dịch 1, 2 và 3. Lưu phôi ở mỗi dung dịch 5 phút để cân bằng. Sau đó làm sạch phôi trong dung dịch mDPBS 3 lần và chuyển sang môi trường nuôi phôi và theo dõi tiếp.
Đông lạnh một bước
Phương pháp này sử dụng chất bảo vệ lạnh là Ethylen glycol và Sucrose.
Chuẩn bị môi trường đông lạnh
Dung dịch 1: DPBS + 0,4% BSA + 20% CS
Dung dịch 2: DPBS + 1,8M (10%) Ethylen glycol + 0,1M Sucrose
Đông lạnh phôi:
Đầu tiên rửa phôi thu được bằng dung dịch thứ 1 ít nhất 3 lần trong đĩa petri vô trùng, thao tác càng nhanh càng tốt. Sau đó hút trực tiếp phôi vào một đĩa khác có chứa dung dịch thứ 2. Hút phôi cùng dung dịch bảo vệ
lạnh vào cọng rạ và để cân bằng ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong vòng 10-15 phút. Sau khi để cân bằng, chuyển cọng rạ vào máy đông lạnh đã được khởi động trước và đang ở nhiệt độ -7oC. Sau 2 phút tạo đá trên cọng rạ bằng panh làm lạnh bằng nitơ lỏng và cọng rạ chứa phôi được duy trì ở
nhiệt độ đó thêm 8 phút nữa. Nhiệt độ sau đó được hạ tự động với tốc độ - 0,3oC/phút đến nhiệt độ -32oC thì dừng lại. Lúc này quá trình đông lạnh đã kết thúc, lấy cọng rạ chứa phôi ra khỏi máy đông lạnh và chuyển phôi vào hộp xốp chứa nitơ lỏng -196oC để bảo quản lâu dài.
Giải đông phôi
Lấy cọng rạ chứa phôi ra khỏi bình nitơ lỏng, giữ trong không khí 6 giây rồi thả vào bình nước ấm ở nhiệt độ 33oC đến khi toàn bộ tinh thể đá tan hết.
Lau sạch cọng rạ chứa phôi bằng cồn 90o. Cắt đầu cọng rạ phía đầu đối diện nút chặn bông để chuyển phôi vào môi trường nuôi cấy để tiếp tục theo dõi.
Đông lạnh theo phương pháp thuỷ tinh hoá
Chuẩn bị môi trường đông lạnh
Môi trường Glycerol EG Xylose PEG (w/v) Sucrose
V1 10% - 10% 1% 0,1M
V2 10% 10% 20% 2% 0,2M (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
V3 10% 30% 30% 3% 0,3M
Trong đó: EG: Ethylen glycol PEG: Poly Ethylen glycol V1: môi trường thuỷ tinh hoá 1 V2: môi trường thuỷ tinh hoá 2 V3: môi trường thuỷ tinh hoá 3
Đầu tiên, rửa phôi ít nhất 3 lần trong môi trường DPBS. Sau đó chuyển phôi vào môi trường V1 và giữ trong 5 phút. Chuyển phôi từ môi trường V1 sang V2 và giữ trong 2 phút. Chuyển phôi từ môi trường V2 sang môi trường V3 và hút ngay vào cọng rạ.
Đông lạnh.
Đưa đầu cọng rạ có phôi vào nitơ lỏng trong 6-7 giây, sau đó từ từ nhấn chìm toàn bộ cọng rạ vào nitơ lỏng rồi chuyển vào bình nitơ để bảo quản.
Giải đông phôi:
Với phương pháp đông lạnh thuỷ tinh hoá quy trình giải đông được tiến hành như sau:
- Chuẩn bị môi trường giải đông Môi trường 1: Sucrose 0,5M Môi trường 2: Sucroses 0,25M Môi trường 3: DPBS + 20% CS
- Tiến hành: đưa cọng rạ ra khỏi nitơ lỏng và giữ trong không khí 6