III. Đóng góp mới của Đề tài
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Phương pháp nghiên cứu ngoài thiên nhiên
3.2.1.1. Lập tuyến điều tra
Chúng tôi phân chia vùng nghiên cứu ra làm nhiều điểm căn cứ vào địa hình, thủy văn, thảm thực vật, mức độ sử dụng khác nhau, để xác định các sinh cảnh chính cần giám sát, đánh giá và thu mẫu (cắt phần ở trên mặt đất mà gia súc có thể sử dụng). Chúng tôi đã lập các tuyến đi cắt qua các sinh cảnh đó, ngoài nghiên cứu trên tuyến đi chúng tôi đã lập một số ô nghiên cứu định vị trên từng kiểu thảm thực vật.
3.2.1.2. Điều tra nghiên cứu theo ô tiêu chuẩn
Để thống kê thành phần loài, từ đó đánh giá về độ đầy của loài trong quần xã, đánh giá vai trò từng loài trong quần xã, nghiên cứu về năng suất, chất lƣợng các loài cỏ chúng tôi đã lập một số ô tiêu trong từng kiểu thảm, diện tích là 1m2 (mỗi kiểu thảm từ 2 - 4 ô). Mô tả theo mẫu phiếu mô tả các quần xã cỏ.
- Lấy mẫu đất: Trên các tuyến nghiên cứu chúng tôi lấy mẫu đất tại ô tiêu chuẩn và các điểm ngoài ô tiêu chuẩn. Mẫu đất lấy ở độ sâu: 0- 20cm và đem phân tích đất tại phòng Thí nghiệp trung tâm - Trƣờng Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên.
- Lấy mẫu cỏ để phân tích: Chúng tôi lấy lá bánh tẻ của một số loài cỏ ƣu thế ở từng điểm nghiên cứu, sau đó đem về phòng thí nghiệm để tiến hành phân tích các chỉ tiêu vật chất khô, protein, lipit, đƣờng và chất xơ.
3.2.1.3. Phương pháp điều tra trong dân
+ Xây dựng phiếu điều tra gồm các mục: tên khoa học, tên Việt Nam, dạng sống, môi trƣờng, độ nhiều, bộ phận sử dụng, hình thức khi sử dụng, năng suất/ ha/.
+ Trực tiếp phỏng vấn dân địa phƣơng. + Gửi phiếu điều tra.
PHIẾU MÔ TẢ CÁC QUẦN XÃ CỎ
Số: ……… Ngày … tháng ... năm ....
Tên thực vật quần: ………... Vùng: ……… Miền: ………..…... Kinh, vĩ tuyến: ……….. Tên địa điểm: ……….…... Thực trạng xung quanh: ………... Độ cao so với mặt biển: ………... Hƣớng phơi: ………... Độ dốc (độ): …………... Đặc điểm chung của địa hình: …………... Tiểu địa hình và nguồn gốc: ……….…... Đặc điểm đất: ………... Độ ẩm và mực nƣớc ngầm: ………... Diện tích ô tiêu chuẩn: ………...
Danh mục các loài trong ô tiêu chuẩn
Stt Tên cây Độ
nhiều Độ phủ (% hình chiếu) cao (cm) Chiều Vật
hậu Ghi chú Tên La tinh Tên Việt Nam
Độ phủ chung của thực vật thƣợng đẳng: độ phủ chiếu: …….. Độ phủ thật:...… Độ phủ của rêu: ………. Địa y:...…... Độ phủ của hòa thảo: ……….…... Sa thảo:... .. Chiều cao của cỏ tối đa: ………... Khối lƣợng cơ bản: ...….
Đặc điểm phân tầng: ………... Trạng thái ngoại mạo: ………... Các vi thức vật quần và quan hệ của nó với điều kiện: ……...……. Lớp cỏ chết: ………... Ảnh hƣởng của con ngƣời: ………... Ảnh hƣởng của động vật (hoang ………... nuôi ...……….. ) Giá trị kinh tế của thảm cỏ: ……….…... Năng suất tƣơi (kg/m2): ………..…... Các đặc điểm khác: ………...
3.2.2. Các phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
Mẫu thực vật thu đƣợc đem về giám định tên khoa học và phân tích trong phòng thí nghiệm.
3.2.2.1. Xác định tên khoa học của các mẫu thực vật
Chúng tôi sử dụng khoá phân loại hiện hành của các tác giả Nguyễn Tiến Bân và cộng sự (2001, 2003, 2005) [8], Lê Khả Kế (1969, 1975) [16], Phạm Hoàng Hộ (1993) [15] và một số tài liệu liên quan đến phân loại thực vật.
3.2.2.2. Nghiên cứu năng suất
Theo phƣơng pháp của Hoàng Chung (2006) [12]. Chúng tôi cắt phần ở trên mặt đất mà gia súc có thể sử dụng đƣợc tại mỗi điểm nghiên cứu. Mẫu mang về phòng thí nghiệm đƣợc phân thành 2 phần: phần tƣơi và phần chết. Phần tƣơi đƣợc phân chia theo các nhóm: Hoà thảo, Xa thảo, cây Họ đậu, cây Thuộc thảo, cây gỗ, cây bụi, dƣơng xỉ… sau đó sấy khô ở nhiệt độ 1050c trong thời gian 10h, cân và tính giá trị trung bình. Phần khô và phần chƣa hoàn toàn mục nằm trên mặt đất thuộc phần chết chung.
3.2.2.3. Xác định dạng sống
Chúng tôi mô tả dạng sống của từng loài theo phƣơng pháp của Hoàng Chung (2004) [11].
3.2.2.4. Đánh giá chất lượng cỏ
Chúng tôi lấy lá bánh tẻ của một số loài cỏ ƣu thế của từng điểm nghiên cứu, tiến hành phân tích các chỉ tiêu nƣớc, vật chất khô, prôtêin, đƣờng, lipit và chất xơ.
a. Xác định lượng vật chất khô trong cỏ [35]
- Nội dung:
Sấy mẫu ở nhiệt độ 1050 C đến khi khối lƣợng mẫu không đổi và xác định sự thay đổi khối lƣợng trong quá trình sấy.
- Dụng cụ:
+ Cân phân tích với độ chính xác đến ± 0,0001 gam. + Tủ sấy điều chỉnh đƣợc nhiệt độ ± 10
C.
+ Hộp nhôm + nắp có đƣờng kính 65 mm, cao 30 mm. + Bình hút ẩm có chứa chất hút ẩm.
- Các bƣớc tiến hành:
Sấy hộp nhôm và nắp ở nhiệt độ 1050
C trong vòng 30 phút, sau đó để nguội trong bình hút ẩm cân chính xác đến 0,0001g.
Mẫu cỏ sau khi mang về phòng thí nghiệm đƣợc cân tƣơi cả túi nilông, lấy cỏ ra phơi khô không khí trong phòng thí nghiệp. Sau một số ngày cân lại, với 3 lần cân có trọng lƣợng không đổi gọi là khô không khí, trọng lƣợng tƣơi của cỏ sẽ là trọng lƣợng lần đầu từ trọng lƣợng túi nilông. Cỏ tƣơi trừ cỏ khô sẽ là lƣợng nƣớc mất đi.
Cân vào hộp nhôm 5g mẫu ở trạng thái khô không khí với độ chính xác 0,0001g. Mở nắp hộp nhôm, đặt nắp xuống đáy của hộp sau đó cho vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 1050C) trong vòng 4 giờ tính từ khi nhiệt độ của tủ sấy đạt 1050
C. Sau khi sấy 4 giờ, chúng ta đậy nắp hộp nhôm lại sau đó lấy ra cho vào bình hút ẩm. Sau khi để nguội đem cân bằng cân phân tích. Khối lƣợng hao hụt sau khi sấy đƣợc coi là lƣợng nƣớc, phần còn lại sau khi sấy kiệt gọi là lƣợng vật chất khô.
- Tính toán lƣợng vật chất khô trong mẫu phân tích (S): Đƣợc tính theo công thức phần trăm (%): 100 1 m m S (3.1)
Trong đó: S là lƣợng vật chất khô trong mẫu (%). m1 là khối lƣợng mẫu sau khi sấy ở 1050C. m là khối lƣợng mẫu trƣớc khi sấy ở 1050
b. Xác định hàm lượng nước trong cỏ
Hàm lƣợng nƣớc = 100% - vật chất khô (%)
c. Phương pháp phân tích hàm lượng chất xơ theo Heenerberg-Stohmann [35] Chất xơ đƣợc coi là tổng hợp của nhiều chất nhƣ xenluloze, hemixenluloze, các chất pectin, lignin. Việc định nghĩa chất xơ không dễ dàng, mà thƣờng đƣợc coi là các chất còn lại sau quá trình thuỷ phân.
Chất xơ thô là phần còn lại của các nguyên liệu có nguồn gốc thực vật sau quá trình thuỷ phân bằng Axít sunfuric và dung dịch Natrihiđroxit.
Chất xơ thực phẩm là phần còn lại của các tế bào thực vật đƣợc phân huỷ bằng các men tiết ra từ các tuyến tiêu hoá. Đó là hỗn hợp xenluloze, hemixenluloze và lignin.
Việc phân tích chất xơ là một phƣơng pháp cổ điển nhƣng luôn luôn là vấn đề cần đƣợc thảo luận thấu đáo. Do quá trình thuỷ phân hoá học các chất trong mẫu phân tích luôn luôn cần một môi trƣờng càng chính xác bao nhiêu càng cho kết quả chính xác bấy nhiêu.
Từ quan điểm trên việc phân tích chất xơ có thể đƣợc tiến hành theo hai cách: Phƣơng pháp hoá học và phƣơng pháp sử dụng enzim. Trong đó, phƣơng pháp phân tích hoá học dùng để phân tích chất xơ là một trong những phƣơng pháp cổ điển nhất của phƣơng pháp phân tích thành phần hoá học có trong thức ăn. Bản chất của phƣơng pháp này xuất phát từ qúa trình thuỷ phân các chất của tế bào thực vật.
- Hoá chất:
+ Dung dịch Axít sunfuric (H2SO4) 0,255 ± 0,005 N. + Dung dịch Natrihiđroxit (NaOH) 0,313 ± 0,005 N. + Acetone.
- Thiết bị:
+ Thiết bị phân tích xơ ANKOM 200/220. + Túi lọc: Sử dụng túi lọc ANKOM F57.
+ Dụng cụ hàn miệng túi: yêu cầu có nhiệt độ cao đủ để làm chảy nhựa polime trong túi lọc (số hiệu # 1915).
+ Tủ sấy.
- Các bƣớc tiến hành:
+ Đánh dấu túi lọc bằng bút không bị xoá trong dung môi. Cân túi lọc (ghi W1.1) sau đó chỉnh cân về không (ấn phím TARE).
+ Túi đối chứng: Cân ít nhất 1 túi không và cho vào cùng phân tích (ghi W1.2), điều này cho phép xác định sai số xảy ra đối với độ ẩm và khối lƣợng của túi.
+ Cân khoảng 1g mẫu cho thẳng vào túi lọc (ghi W2). Mẫu cân phải cho sát đáy túi. + Hàn miệng túi khoảng 4mm tính từ miệng túi bằng dụng cụ hàn túi. Dàn đều mẫu trong túi bằng lắc hoặc gõ túi. Tránh không để mẫu gần phần hàn miệng túi (trong phạm vi 4mm).
+ Đặt tối đa 24 túi vào khay chứa túi của máy ANKOM. Sử dụng tất cả chín khay mà không quan tâm đến số túi phân tích. Đặt 3 túi vào một khay và xếp các khay vào trục đứng, mỗi cái lệch nhau một góc là 1200. Đặt cả trục chứa các khay mẫu vào buồng phân tích, đặt khối sắt hình trụ lên khay thứ 9 không chứa mẫu để dìm toàn bộ khay xuống.
+ Khi phân tích 24 túi lọc, đổ vào đó 1.900 - 2.000 ml dung dịch axit có nhiệt độ ổn định cho đến khi ngập túi lọc. Nếu phân tích ít hơn 20 túi, cho theo tỉ lệ 100ml axit/ 1 túi (tối thiểu phải có 1.500 ml).
+ Công phá 40 phút bằng dung dịch Axít sunfuric (H2SO4) 0,255 ± 0,005N, sau đó rửa nƣớc cất 2 lần (mỗi lần 5 phút).
+ Công phá 40 phút bằng dung dịch Natrihiđroxit (NaOH) 0,313 ± 0,005 N, sau đó rửa bằng nƣớc cất tất cả 3 lần.
+ Tháo túi lọc khỏi khay, bóp nhẹ cho bớt nƣớc thừa. Cho túi vào cốc thuỷ tinh thể tích 250 ml, cho thêm acetone ngập túi. Ngâm khoảng 3- 5 phút, lấy túi mẫu ra, nhẹ nhàng bóp để rút bớt acetone.
+ Trải đều túi lọc để khô không khí. Cho vào tủ sấy đặt nhiệt độ 1050C, sấy trong vòng 2 - 4 giờ.
(Chú ý: Không cho túi lọc vào tủ sấy trƣớc khi acetone khô hết).
+ Sau khi sấy khô, lấy túi lọc ra cho vào bình hút ẩm. Để nguội và cân (ghi W3). Tính lƣợng xơ và khoáng của mẫu bằng công thức W4:
W4 = W3 – W1.1
+ Đƣa cả túi đối chứng và túi chứa mẫu vào đốt trong lò nung ở nhiệt độ 5500C trong vòng 2 giờ, để nguội trong bình hút ẩm và cân (ghi W5.1 là khối lƣợng chén + khoáng của mẫu, W5.2 là khối lƣợng chén + bao đối chứng sau đốt).
Tính lƣợng khoáng thực sự của mẫu nhƣ sau:
W5 = (W5.1 – WCM) – (W5.2 – WCĐC) Trong đó: WCM là khối lƣợng chén dùng đốt mẫu.
WCĐC là khối lƣợng chén dùng đốt bao đối chứng.
- Tính toán kết quả:
Hàm lƣợng xơ thô tính bằng % theo công thức sau:
100 2 5 4 W W W X (3.2)
Trong đó: X: Hàm lƣợng xơ thô ( % )
W2: Khối lƣợng mẫu phân tích tính bằng gam
W4: Khối lƣợng chất xơ + khoáng sau khi lọc ete, axit, bazơ và acetone. W5: Khối lƣợng tro của chất xơ sau khi nung
d. Phân tích hàm lượng Protein thô theo phương pháp MicroKjeldanl [9]:
- Nguyên lý:
Trong phƣơng pháp MicroKeldan ngƣời ta vô cơ hoá mẫu bằng H2SO4 98% kết hợp với chất xúc tác để chuyển nitơ hữu cơ ra dạng (NH4)2SO4, rồi dùng NaOH để đẩy NH3 ra khỏi muối Amoni, NH3 sau khi đƣợc giải phóng ra sẽ đƣợc cuốn đi bằng dòng hơi nƣớc nóng. Sau khi đƣợc làm nguội sẽ đƣợc hấp thụ vào dung dịch H3BO3 ở trong bình hứng tạo ra muối borat amon có màu xanh trong.
(NH4)2SO4 + 2NaOH = 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O 3NH3 + H3BO4 = (NH4)3BO3
Để xác định đƣợc lƣợng amoniac giải phóng ra trong quá trình chƣng cất ta đem đi chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,1N đến khi nào dung dịch chuyển sang mầu tím nhạt là đƣợc.
2(NH4)3BO3 + 3H2SO4 → 3(NH4)2SO4 + 2 H3BO3
Từ lƣợng axit H2SO4 0,1N tiêu tốn trong quá trình chuẩn độ chúng ta tính đƣợc lƣợng nitơ có trong mẫu.
- Dụng cụ:
Ống công phá mẫu; Bình tam giác 300 ml
- Hoá chất:
H2SO4 đậm đặc 98%; Viên xúc tác Kjeldahl (hỗn hợp Cu và Se); H2SO4 0,1N; NaOH 33%; H3BO3 4% cùng với chất chỉ thị màu Tashio (gồm hỗn hợp xanh Methylen và đỏ Methylen); Nƣớc cất.
- Cách tiến hành:
Giai đoạn công phá mẫu:
+ Bƣớc 1: Cân mẫu:
Mẫu đƣợc xấy khô ở nhiệt độ 50 - 600C, sau đó nghiền nhỏ.
Tiến hành: Cân chính xác và cẩn thận bằng cân phân tích (có độ chính xác 0,0001) 1-1,5 g mẫu cho vào bình công phá (trƣớc khi cho mẫu đã cân vào ống thì ta phải cho vào ống 1 viên xúc tác trƣớc), sau đó cho vào 10 ml H2SO4 đậm đặc, bịt chặt ống đốt mẫu bằng giấy thiếc và ngâm qua đêm.
Chú ý: Để tăng độ chính xác khi phân tích, chúng ta phải bố trí 1 ống Kjeldahl đối chứng chỉ có chất xúc tác và 10 ml H2SO4 đậm đặc mà không có mẫu phân tích, tiến hành tất cả các bƣớc nhƣ mẫu phân tích thật.
+ Bƣớc 2: Công phá mẫu:
Nhiệt độ cần cho quá trình công phá là 3800C, thời gian công phá là 40 phút. Khi quá trình công phá đã đƣợc ta đợi nhiệt độ của ống Kjeldahl hạ xuống bằng nhiệt độ môi trƣờng rồi đƣa vào chƣng cất.
Giai đoạn chưng cất và phân tách amoniac sau khi công phá:
Sau khi công phá xong ta tiến hành chƣng cất trên máy cất đạm tự động Gerhardt. Máy tự động hút dung dịch NaOH, H3BO3 và nƣớc cất. Thời gian chƣng cất là 5 phút dung dịch sau chƣng cất có mầu xanh.
Giai đoạn xác định lƣợng amoniac giải phóng ra sau quá trình chƣng cất: Để xác định đƣợc lƣợng amoniac giải phóng ra trong quá trình chƣng cất ta đem đi chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,1N đến khi nào dung dịch chuyển sang mầu tím nhạt là đƣợc, từ lƣợng axit H2SO4 0,1N tiêu tốn trong quá trình chuẩn độ chúng ta tính đƣợc lƣợng đạm có trong mẫu.
- Tính kết quả: Dựa trên lƣợng axit sunphuaric 0,1N tính ra hàm lƣợng prôtein có trong mẫu.
e. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp Bertrand [9]:
- Nguyên tắc:
Đƣờng khử do trong cấu trúc có nhóm aldehit có tính khử mạnh nên có khả năng tham gia phản ứng tráng bạc và phản ứng với dung dịch Fehling.
R – CHO + 2AgNO3 + 3NH3 + H2O → R – COONH4 + 2NH4NO3 + 2Ag ↓ R – CHO + 2 Cu(OH)2 → R- COOH + Cu2O ↓ + 2H2O.
Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 → 2CuSO4 +2 FeSO4 + H2O
10 FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 → K2SO4 + 2MnSO4 + 5 Fe2(SO4)3 + 8H2O. Khi dùng dung dịch chuẩn KMnO4 0,1N để chuẩn độ lƣợng FeSO4 tạo thành, từ thể tích tiêu tốn khi tra bảng sẽ tìm đƣợc số mg đƣờng khử và áp dụng công thức ta sẽ tìm đƣợc hàm lƣợng đƣờng hay tinh bột trong mẫu.
- Cách tiến hành:
Công đoạn chiết, tách và thuỷ phân: Cân một lƣợng mẫu cỏ sao cho khi pha xong có hàm lƣợng từ 4 -10% đƣờng. Mẫu cỏ đƣợc cắt nhỏ rồi nghiền mịn, sau đó thêm vào khoảng 50ml nƣớc, đun cách thuỷ ở 800C trong 15 phút, để nguội khử tạp chất rồi định mức đến thể tích cần chiết (100 - 150 ml) cả bã, lọc lấy dịch trong. Dung dịch này chỉ phân tích đƣợc hàm lƣợng đƣờng khử (monosaccarit).
Tiến hành phân tích: Lấy 10ml dung dịch Fehling A và 10 ml dung dịch Fehling B cho vào cốc có dung tích 250cc, đun sôi, thêm 10ml dung dịch phân tích và khoảng 20ml nƣớc sôi. Dung dịch phía trên phải có màu xanh, nếu không phải làm lại với lƣợng dịch lọc ít hơn. Nhƣng tổng thể tích dung dịch cuối cùng trong cốc phải bằng 50ml. Sau lọc kết tủa qua phễu, giữ kết tủa trong cốc, tráng bằng
nƣớc cất sôi một vài lần, sao cho hết màu xanh trên phễu lọc, hoà tan tủa trong cốc bằng 30ml dung dịch Fe2(SO4)3. Lấy bình hứng ra và chuẩn độ bằng dung dịch KMnO4 0,1N, đến khi xuất hiện màu hồng.
* Hàm lượng đường khử được tính theo công thức:
A.1000 10. 100 . .G V X(%) (3.3)
Trong đó: X là hàm lƣợng đƣờng khử có trong mẫu (%). V: thể tích dung dịch pha ban đầu