KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1.4. Xây dựng quy trình PCR multiple
Việc sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi trong phản ứng PCR multiplex có một số thuận lợi về chi phí, thao tác, thời gian nhưng lại gặp phải một số vấn đề: (1) sự tương tác giữa các cặp mồi trong cùng phản ứng có thể làm giảm hiệu quả nhân bản tổng thể; (2) một hoặc vài cặp mồi có thể có hiệu quả nhân bản cao hơn những cặp mồi còn lại, dẫn đến sự “thiên lệch” (PCR drift) trong quá trình nhân bản các trình tự mục tiêu khác nhau. Để hạn chế các vấn đề nêu trên, chúng tôi khảo sát một số điều kiện để tối ưu hóa phản ứng PCR multiplex với 4 cặp mồi. Các điều kiện khảo sát bao gồm: (1) nồng độ 4 cặp mồi sử dụng trong phản ứng nhằm đạt được hiệu quả nhân bản tương đương giữa 4 trình tự mục tiêu; (2) nồng độ MgCl2 cho hiệu quả nhân bản tổng thể tốt nhất; và (3) nhiệt độ lai cho hiệu quả nhân bản đồng đều giữa các cặp mồi.
Các mẫu dùng trong khảo sát này là 2 chủng H. pylori ATCC và 3 mẫu lâm sàng đã được giải trình tự như trên.
Trước tiên, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR multiplex sử dụng thành phần cơ bản và nồng độ 4 cặp mồi như nhau (200 nM), cùng với chương trình nhiệt sử dụng cho phản ứng PCR monoplex. Kết quả được trình bày trong hình 3.10.
Hình 3.10. Điện di sản phẩm PCR multiplex kết hợp 4 cặp mồi trên DNA của 2 chủng H. pylori ATCC và 3 mẫu lâm sàng. Giếng 1, 2, 3 gồm 3 mẫu lâm sàng; giếng 4: chủng J99; giếng 5: chủng Tx30a. IC : chứng nội
Kết quả cho thấy, ở tất cả các mẫu, sản phẩm nhân bản từ mồi chứng nội cho tín hiệu mạnh hơn so với tín hiệu sản phẩm nhân bản từ các cặp mồi khác. Như vậy, đã có sự “thiên lệch” trong quá trình nhân bản 4 trình tự mục tiêu, với cặp mồi dùng cho chứng nội có ưu thế hơn hẳn các cặp mồi khác.
Bước tiếp theo khảo sát các nồng độ khác nhau của cặp mồi chứng nội.