KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1.5. Đánh giá độ nhạy của quy trình và so sánh kết quả với kit thƣơng mạ
Để xác định độ nhạy của phương pháp multiplex PCR, trước tiên chúng tôi định lượng DNA bộ gene của H. pylori trong 3 mẫu lâm sàng dương tính với H. pylori bằng kit thương mại định lượng H. pylori (Primer design).
Sau đó chúng tôi pha loãng các mẫu theo bậc mười tới mức pha loãng 10.000 lần và xác định giới hạn phát hiện của phương pháp cho từng mẫu dựa trên kết quả định lượng nêu trên.
Hình 3.15. Điện di sản phẩm PCR multiplex từ các nồng độ DNA H. pylori (hình 3.15 A) và kết quả tương ứng sử dụng kit định lượng thương mại (hình 3.15 B).
Kết quả trên 3 mẫu (hình 3.15 A) cho thấy phương pháp multiplex PCR cho phép phát hiện H. pylori trong các mẫu khảo sát lần lượt ở độ pha loãng 10, 100 và 1000 lần, mức pha loãng 10.000 lần cho kết quả âm tính.
Kết quả định lượng tại những độ pha loãng 10, 100 và 1000 lần tương ứng với số lượng bản sao tính theo lý thuyết lần lượt là 48 bản sao/phản ứng (10 bản sao/µl DNA tách chiết); 132 bản sao/phản ứng (26 bản sao/µl DNA tách chiết); và 64 bản sao/phản ứng (12 bản sao/ µl DNA tách chiết).
Như vậy, ngưỡng phát hiện của phản ứng PCR multiplex mà chúng tôi xây dựng là 10 bản sao/µl DNA tách chiết hoặc 50 bản sao/phản ứng so với ngưỡng 20 bản sao/phản ứng của kit thương mại. Độ nhạy cao hơn của kit thương mại chủ yếu dựa trên sự phát hiện tín hiệu huỳnh quang vốn nhạy hơn việc nhận định bằng mắt thông qua điện di trên gel agarose.
Chúng tôi tiến hành so sánh hoạt động của quy trình PCR multiplex đã xây dựng và kit thương mại trên 30 mẫu bệnh phẩm (Phụ lục 4). Kết quả ở bảng 3.2.
A
Bảng 3.2. Kết quả phát hiện H. pylori bằng kit thương mại và so với quy trình PCR multiplex đã xây dựng
Kết quả so sánh Quy trình PCR multiplex Kit thương mại PrimerDesign
Dương tính (số mẫu) 20 20
Âm tính (số mẫu) 10 10
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy kết quả phát hiện H. pylori giữa quy trình multiplex PCR đã xây dựng so với kit thương mại tương đương nhau. Tuy nhiên, mỗi qui trình có ứng dụng riêng, quy trình multiplex PCR đã xây dựng cho phép định týp gene cagA (+) hoặc cagA (-); vacA s1/s2 và vacA m1/m2 của H. pylori. Trong khi quy trình của kit
thương mại thì cho phép định lượng H. pylori trong mẫu.