Cellulase được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực khác nhau như trong sản xuất thức ăn gia súc, trong sản xuất thực phẩm và đồ uống, trong dệt may, trong sản xuất giấy và đặc biệt trong sản xuất nhiên liệu cồn sinh học [54].
Trong sản xuất bia, rượu và các loại đồ uống lên men từ ngũ cốc, cellulase chủ yếu hỗ trợ quá trình phân giải celluloase làm tăng hiệu quả quá trình lọc dịch đường sau thủy phân hoặc làm trong dịch lên men, giảm độ nhớt v.v…Các quá trình này chủ yếu sử dụng các cellulase dưới dạng các thương phẩm [55].
Trong chế biến thức ăn gia súc cellulase phân hủy chất xơ cĩ trong nguyên liệu nhằm tăng giá trị chuyển hĩa của thức ăn đối với động vật [56][57].
Trong cơng nghiệp dệt may cellulase được sử dụng với mục đích làm mềm, mịn, sạch và ổn định màu sắc của vải, trong các cơng đoạn của quá trình sản xuất endoglucanse được bổ sung để loại bỏ các sợi xơ ngắn trên bề mặt vải và các bụi bẩn trong mạng lưới vi sợi. Ngồi ra, trong sản xuất quần jean cellulase cịn được sử dụng để tạo ra các vêt xước, rách “stonewashing” theo ý muốn mà khơng gây tổn hại đến vải, với cách này đã thay thế được [56].
Nhiên liệu sinh học là nguồn nguyên liệu thay thế các nguyên liệu hĩa thạch quan trọng, ngày nay nhiều quốc gia đang tìm cách để giảm sự phụ thuộc vào nhiên liệu hĩa thạch. Một trong những bước quan trọng trong sản xuất nhiên liệu sinh học là chuyển hĩa lignocelluloses thành đường cĩ thể lên men. Hiệu quả của quá trình này phụ thuộc vào mức độ phân giải hiệu quả của hệ enzym phân giải lignocellulose [58].
Sinh khối Lignocellulose là nguồn năng lượng tái tạo với trữ lượng lớn trên trái đất. Tuy nhiêu quy trình sản xuất ethanol sinh học từ sinh khối phức tạp hơn nhiều so với việc sản xuất ethanol từ tinh bột hay từ đường. Để giảm được chi phí cho quá trình này cần cĩ nguyên liệu thơ chi phí thấp, hệ enzym hiệu quả và các phương pháp tiền xử lý. Sinh khối cellulose là nguyên liệu cĩ giá thành thấp, cĩ thể tận dụng từ các phụ phẩm của các ngành khác và cĩ thể tái tạo. Những vật liệu này bao gồm dăm gỗ, rơm rạ, bã mía, cây trồng, cỏ, lõi ngơ v.v…Trong quá trình thủy phân đường đơn được tạo ra nhờ sự chyển hĩa của hệ enzym cellulase và hemicellulase [24]
Quá trình thủy phân các bã thải nơng nghiệp: bã mía, lõi ngơ,...bằng enzym được nghiên cứu rộng rãi tùy thuộc vào mục đích và khả năng ứng dụng của các sản phẩm thu được sau khi thủy phân. De Guilherme và cs (2017) đã sử dụng một nhĩm các enzym: phức hợp cellulase với β-glucosidase, phức hợp (arabinase, β-glucanase, cellulases, hemicellulases, pectinase, xylanase), β-glucosidase và xylanase để thủy phân bã mía được tiền xử lý bằng acid kết hợp với kiềm để tăng cường sản xuất glucose và xylose. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy rằng quá trình kết hợp tiền xử lý này làm tăng lượng cellulose lên 68,3%, giảm 16,2% lượng hemicellulose do quá trình tiền xử lý trước bằng acid làm một lượng hemicellulose bị hịa tan. Lượng lignin trong sinh khối giảm 10,9% [59].
Sự kết hợp các enzym khác nhau để thủy phân làm tăng hiệu suất chuyển hĩa bã mía thành đường, cải thiện nồng độ cuối cùng của glucose và xylose trong mơi trường lên men. Việc sử dụng phức hợp cĩ chứa xylanase trong hỗn hợp enzym đã làm tăng lượng glucose và xylose lên 12,7% và 378,4% so với các nghiên cứu trước [59].
Nhiều nghiên cứu đã sử dụng cellulase thu nhận từ vi sinh vật kết hợp các phương pháp tiền xử lý để thủy phân hiệu quả lignocellulose. Sulaiman và cộng sự sử dụng cellulase từ Geobacillus stearothermophilus để thủy phân rác thải giàu cellulose từ cây chà là đã được tiền xử lý, kết quả hiệu suất đường hĩa đạt 71,03% [55]. Han và cộng sự cũng đã kết hợp phương pháp tiền xử lý bằng kiềm khi sử dụng cellulase thu nhận từ Penicillium waksmanii F10-2 để thủy phân rơm từ lúa mỳ, quá trình thủy phân đạt tối ưu ở điều kiện thời gian phản ứng 30 giờ, nồng độ cơ chất 3%, nhiệt độ 55ºC và pH 5,0 hàm lượng đường khử tạo thành cao nhất đạt 350mg/g cơ chất [60]. Tsai và cộng sự cũng đã kết hợp enzym thủy phân cellulose với các phương pháp tiền xử lý khác nhau khi thủy phân cỏ voi, kết quả nghiên cứu đã lưa chọn phương pháp tiền xử lý bằng NaOH với cellulase (CTec2) cho hiệu suất thủy phân cao nhất đạt 74,5% [61].
Radhika và cộng sự đã tối ưu hĩa quá trình thủy phân sinh khối cây cao lương đã tiền xử lý bằng axit sử dụng cellulase từ Aspergillus sp, hiệu suất thủy phân cao nhất là đạt 55,97% [62].
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh một số nhiên liệu sinh học như ethanol sinh học, khí sinh học … và một số hợp chất, dược phẩm quan trong trọng cĩ thể được sản xuất từ nguồn lignocellulose. Sản xuất năng lượng sinh học từ nguồn lignocellulose thải được gọi là năng lượng sinh học thế hệ thứ hai. Khác với thế hệ thứ nhất là, năng lượng sinh học được sản xuất từ lương thực như bắp, sắn, đậu hay một số loại cây dầu, sự sản xuất năng lượng sinh học thứ hai khơng gây áp lực lên nhu cầu cung cấp lương thực. Trong đĩ sản xuất ethnol sinh học từ sinh khối lignocellulose thải nhận được nhiều sự quan tâm vì nĩ giải quyết vấn đề ơ nhiễm mơi trường và tăng lợi ích kinh tế [63]
Tại Việt Nam Phan Thị Phẩm và cộng sự đã nhận thấy tiềm năng trong việc chuyển đổi sinh khối lignocellulose trong sản xuất ethanol sinh học, tác giả đã nhận thấy các nguyên liệu lignocellulose rất dồi dào ở Việt Nam, ước tính 113,7 triệu tấn/năm và bằng cách tiếp cận với cơng nghệ mới để đẩy mạnh việc nghiên cứu sâu hơn để cĩ thể áp dụng sản xuất ethanol sinh học từ nguồn lignocellulose thải [51].
1.4. Ứng dụng giải trình tự genome để phát hiện tiềm năng vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase trong phân giải lignocellulose
Giải trình tự tồn bộ gen là phương pháp tồn diện nhất để phân tích dự đốn chức năng các gen liên quan [64]. Phương pháp giải trình tự tồn bộ gen đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu để thúc đẩy nhanh chĩng trong việc khám phá ra các chủng sinh cellulase và hemicellulase tiềm năng.
Pasari và cộng sự giải trình tự hệ gen chủng vi khuẩn Paenibacillus polymyxa A18 được phân lập từ ruột mối, kết quả xác định được 4608 trình tự gen mã hĩa, nhiều gen mã hĩa các enzym liên quan đến thủy phân cacbohydrat, bao gồm các enzym chịu trách nhiệm thủy phân gỗ [65].
Nghiên cứu khác của Zheng và cộng sự bằng phương pháp giải trình tự bộ gen của chủng Cellulosimicrobium sp. TH-20 đã khám phá được các gen chức năng liên quan đến sự biến đổi ginsenoside. Ginsenoside là hoạt chất sinh học chính của nhân sâm giúp chống mệt mỏi, chống dị ứng, chống viêm, chống ung thư. Glycosidase được coi là cơng cụ hữu ích để xúc tác quá trình thủy phân các phân tử ginsenoit tạo ra ginsenoside. Chi Cellulosimicrobium đã thu hút được sự chú ý nhờ khả năng sinh glycosidase, bao gồm endo-beta-1,4-glucanase, endo-beta-1,4- xylanase, endo-beta-1,4-mannanase và endo-beta-1,3-glucanase [66]
Phân tích trình tự hệ gen vi khuẩn chịu mặn Parvularcula flava NH6-79T đã dự đốn 3465 gen, 96 gen trong số đĩ thuộc glycoside hydrolase (GHs). Trong các GH này, 20 gen được mã hĩa cĩ liên quan đến sự phân hủy cellulose, bao gồm 12 endoglucanase (5 GH10, 4 GH5 và 3 GH51), 2 exoglucanase (GH9) và 6 β- glucosidase (GH3). Ngồi ra, hoạt độ enzym tương đối cao nhất (endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase) được quan sát thấy ở giờ thứ 27 khi chủng được nuơi cấy trong mơi trường chứa carboxymethyl cellulose/Avicel trong 45 giờ. Sự kết hợp giữa phân tích bộ gen với các nghiên cứu thực nghiệm đã chỉ ra khả năng của chủng NH6-79 T trong việc sinh tổng hợp endoglucanase, exoglucanase và β- glucosidase ngoại bào. Những phát hiện này cho thấy tiềm năng của chủng
Parvularcula flava NH6-79 T trong việc phân hủy sinh khối chứa cellulose và chủng này cĩ thể được sử dụng trong quá trình thu nhận cellulase [67].
Micromonospora sp CP22 được báo cáo là chủng cĩ khả năng phân giải sinh khối lignocelluloses dựa trên 63 CAZyme được tìm thấy trong bộ gen đã được giải trình tự của chủng, theo cơng bố của An và cộng sự 2021 [68].
Bộ gen B. velezensis LC1 được chứng minh cĩ 31 gen liên quan đến sự phân giải lignocellulose, trong đĩ cịn cĩ sự cĩ mặt của các gen hỗ trợ, phát hiện này cĩ ý nghĩa rất lớn trong việc đánh giá về hệ gen từ vi khuẩn sống cộng sinh trong ruột mối theo cơng bố của Li và cộng sự 2020 [69]
Nhằm nghiên cứu sự kết hợp của vật chủ mối và vi sinh vật đường ruột của chúng trong quá trình tiêu hĩa lignocellulose, Tartar và cộng sự đã phân tích song song trình tự 2 thư viện cDNA của các sinh vật cộng sinh trong ruột mối và của vật chủ mối bậc thấp R. flavipes để tìm gen mã hĩa lignocellulase của mối cũng như của vi sinh vật cộng sinh trong đường ruột của chúng. Cả 2 thư viện cĩ tất cả 10.000 EST và dự đốn được chức năng của 6.555 EST. Trong số các EST dự đốn được, cĩ 171 gen lignocellulase gồm 77 gen cellulase, 45 gen hemicellulase, 14 gen chitinase và 17 gen α-carbonhydrolase. Tỷ lệ các gen cellulase và hemicellulase của sinh vật ruột mối cao hơn nhiều so với của vật chủ mối. Cellulase của động vật nguyên sinh chiếm 66%, của sinh vật nhân sơ chiếm 18% trong tổng số các gen cellulase; gen hemicellulase của động vật nguyên sinh chiếm 69% và cịn lại là của sinh vật nhân sơ. Ngồi ra, cĩ 2 gen mã hĩa dokerin và 7 gen mã hĩa CBM (carbohydrate binding module) cellulase và hemicellulase cũng được dự đốn thuộc sinh vật nhân sơ đường ruột mối [70].
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu
2.1.1. Mẫu mối
Mối thu thập tại các thân cây gỗ, mía mục tại huyện Thanh Chương, Nghi Lộc, núi Quyết thành phố Vinh, các tổ mối tại khuơn viên trong trường Đại học Bách khoa Hà nội trong khoảng thời gian từ tháng từ 2014 -2016.
Bảng 2.1. Thơng tin các mẫu mối
Ký hiệu mẫu mối 01 02 03 04 05 06 07
2.1.2. Các chủng vi khuẩn
Các chủng phân lập được lưu giữ
gian làm thí nghiệm, chủng được giữ ở trong glycerol 15% ở -20 °
C. Trong thời 4ºC, định kỳ cấy chuyền tại phịng thực
hành vi sinh thuộc trung tâm thực hành thí nghiệm Đại học Vinh, và phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ sinh học, Đại học Bách Khoa Hà nội.
2.2. Thiết bị và hĩa chất 2.2.1 Thiết bị
Nồi hấp thanh trùng (Hirayama, Nhật Bản), Kính hiển vi chụp ảnh (Optia - Italia); Máy đo mật độ quang UV-VIS (BIOVUAVEII – Mỹ), Máy đo pH (PL-600- MRC - Israel); Tủ cấy vơ trùng (ESSCONG4A4-F8 - Singapore); Tủ nuơi lắc (SV 22 –Đức); Tủ lưu mẫu; Cân phân tích -PA 214-Ohaus - Mỹ - 2017, Vortex 2017 (Italia); Máy ly tâm lạnh (Hetich – Đức)- Thiết bị phân tích HPLC (Agilent, Mỹ)
Các thiết bị và các phần mềm trong nghiên cứu sinh học phân tử. Phiến 96 giếng (SPL Life Sciences, Hàn Quốc); Buồng đếm hemocytometer; Máy đọc ELISA (ELISA Bio-Rad machine, Mỹ); Máy PCR (Applied Biosystem 9700, Mỹ); máy ổn nhiệt (Labnet, Mỹ); bộ điện di agarose; máy soi gel (Bio-radMỹ); kính hiển vi quét (JSM-5410; JEOL, Tokyo); Máy giải trình tự ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystem, USA); máy quang phổ NanoDrop Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham MA, USA); máy đọc trình tự IonTorrent PGM (Life Technologies, Carlsbad, Mỹ) (Viện cơng nghệ sinh học); Máy tính chủ tính tốn hiệu năng cao với bộ vi xử lý gồm 24 CPU Intel(R) Xeon (R) CPU X5650@2.67GHz, dung lượng RAM là 188 GB, dung lượng lưu trữ là 8TB và được cấu hình trên hệ điều hànhUbuntu phiên bản 15.04 Vivid với các phần mềm tin sinh học (Mọi phân tích thí nghiệm đều được thực hiện trên máy chủ hiệu suất cao của phịng Tin sinh học, Viện Cơng nghệ sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam)
2.2.2. Hĩa chất
Các hĩa chất cao nấm men (Merk), CMC (Sigma), peptone (Merk), agar (Việt nam), cellulose thơ (giấy lọc Whatman No1, Sigma), DNS (Trung Quốc), Congo đỏ (Trung Quốc).
Các loại muối khống cĩ chất lượng dùng cho phân tích cĩ xuất xứ Trung Quốc: NaCl, NaNO3, K2HPO4, MgSO4, CaCl2, NaOH,
Sodium dodecyl sulfate (SDS); axit ethylene diamine tetra-acetic (EDTA) (BioLabs, Mỹ)
Taq DNA polymerase (Thermo scientific, Mỹ); d-NTPs (Fermentas, Mỹ), bộ kit tinh sạch DNA từ gel agarose; bộ kit tách hệ gen của vi khuẩn PureLink®Genomic DNA kit (Thermo Fisher Scientific, Inc.Mỹ).
2.3. Các mơi trƣờng nuơi cấy
2.3.1. Mơi trƣờng làm giàu vi khuẩn sinh cellulase
Mơi trường M1: NaNO3 2,5g/l, KH2PO4 2g/l, CaCl2.6H2O 0,1g/l, NaCl 0,1g/l MgSO4: 0,2g/l, CMC 5g/l, hoặc giấy lọc 5g/l[71].
Mơi trường M2: NaNO3 2,5g/l, KH2PO4 1 g/l, KCl 2 g/l, Peptone 2g/l, MgSO4 0,5g/l, CMC 5g/l, hoặc giấy lọc 5g/l [71].
Mơi trường M3: K2HPO4 2,2g/l, KH2PO4 1,5g/l, (NH4)2SO4 1,3g/l, CaCl2 0,02g/l, FeSO4 0,001g/l, MgCl2 0,1g/l, CMC 5g/l, hoặc giấy lọc 5g/l.
Mơi trường M4: Gồm mơi trường M3 + Glucose: 0,2g/l Mơi trường M5: Gồm mơi trường M3 + Peptone: 0,2g
Mơi trường M6: Cám gạo 2%, bột đậu nành 1%, casein 1%, NaCl 0.1%.
2.3.2. Mơi trƣờng giữ giống, nhân giống và phân lập
Mơi trường D5: NaNO3 2g/l, K2HPO4 1g/l, MgSO4 2g/l, KCl 1g/l, Pepton 2g/l, CMC 5g/l, Agar 18g/l, pH 7 [71].
2.3.3. Mơi trƣờng sinh tổng hợp enzyme
Mơi trường LB cĩ bổ sung cơ chất: Tryptone 10g/l, Yeast extract 5g/l, NaCl 5g/l, NaCl 5g/l, CMC 5g/l hoặc giấy lọc 5g/l.
Mơi trường M6: giống với mơi trường hoạt hĩa. Mơi trường M3 (Giống với mơi trường hoạt hĩa) [72].
Mơi trường D6: Pepton 2g/l; CMC 10g/l; K2HPO4 4g/l, MgSO4 0,06g/l; (NH4)2SO4 0,5g/l; Gelatin 0,4g/l [8].
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu trong luận án được thực hiện theo Sơ đồ nghiên cứu mơ tả trên Hình 2.1.
2.4.1. Phƣơng pháp phân lập và tuyển chọn chủng sinh tổng hợp cellulase
2.4.1.1. Phân lập vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối
Quá trình làm giàu vi khuẩn sinh cellulase được thực hiện theo nghiên cứu của Sreena và cs., 2015 [25]. Lấy 1g mối sau khi thu nhận từ các thân cây gỗ mục, từ rơm, thân cây mía được rửa sạch, khử trùng bề mặt bằng ethanol 70% sau đĩ cắt bỏ đầu, giữ lại phần thân, sau đĩ cho vào ống nghiệm, nghiền nhỏ và thêm 5ml nước muối sinh lý vơ trùng. Sau khi trộn đều, hút 1ml dịch mối nghiền cho vào bình tam giác cĩ chứa mơi trường làm giàu (M1, M2, M3, M4 và M5 và đem nuơi lắc ở nhiệt độ phịng. sau 3 ngày đối với mơi trường CMC và 14 ngày đối với cơ chất giấy lọc. Quá trình hoạt hĩa kết thúc khi mơi trường bị đục hoặc cơ chất giấy lọc bị phân giải. Quá trình phân lập được tiến hành trên mơi trường rắn trên đĩa thạch (D5), pha lỗng mẫu mối đã được hoạt hĩa với hệ số pha lỗng từ 10-4 đến 10-7, hút 0,1ml cấy lên mơi trường rắn và chang đều, nuơi ở 30ºC trong 2-7 ngày cho đến khi thấy xuất hiện khuẩn lạc, quan sát hình thái khuẩn lạc, sau đĩ cấy vào mơi trường thạch nghiêng để xác định khả năng sinh cellulase và giữ giống [25]. Các chủng phân lập được, tiếp tục được cấy chấm điểm trên mơi trường rắn và thử với thuốc thử congo để xác định chủng cĩ khả năng tạo vịng thủy phân. Chủng cĩ khả năng phân giải CMC sẽ tạo ra xung quanh khuẩn lạc vịng thủy phân trong suốt.
Quá trình phân lập vi khuẩn sinh cellulase từ mơi trường làm giàu như mơ tả trên Hình 2.2.
Hình 2.2Các bước phân lập vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối [25]
2.4.1.2. Xác định định tính khả năng sinh cellulase của các chủng vi khuẩn phân lậpCác chủng vi khuẩn được thử khả năng sinh cellulase trên đĩa thạch bằng cách cấy Các chủng vi khuẩn được thử khả năng sinh cellulase trên đĩa thạch bằng cách cấy chấm điểm trên mơi trường rắn D5 cĩ chứa 1% CMC, nuơi ở 30°C, trong 48 giờ. Sử dụng thuốc thử congo đỏ 1% trên đĩa thạch, để yên 15 phút sau đĩ đổ sạch thuốc thử congo đi rồi rửa lại bằng dung dich NaCl 1M trong 20 phút, tiếp đĩ đổ hết dung dịch NaCl ra khỏi đĩa thạch và quan sát sự hình thành vịng thủy phân xung quanh khuẩn lạc. Chủng cĩ khả năng sinh cellulase là chủng mà xung quanh khuẩn lạc tạo vịng thủy phân trong suốt [25]. Năng lực thủy phân của chủng phân