Trong tồn bộ các trình tự mã hĩa protein thì 79.5% (3216 trong 4046) được phân vào 21 trong 25 nhĩm chức năng COG. Trong đĩ, các nhĩm chiếm nhiều nhất là: phiên mã (K: 365 trình tự), vận chuyển và chuyển hĩa carbonhydrate (G: 307), vận chuyển và chuyển hĩa amino acid (E: 224), sản sinh và chuyển hĩa năng lượng (C: 199), và vận chuyển và chuyển hĩa (P: 180). Ngược lại, nhĩm liên quan đến việc điều hịa chu trình, phân chia tế bào và nhiễm sắc thể (D: 33), cấu tạo và điều khiên sợi nhiễm sắc (B: 2) và di chuyển tế bào (N: 1) là các nhĩm chiếm ít nhất.
Việc phân tích chức năng của các gen cung cấp cái nhìn sâu hơn về các chức năng của chủng MP1. Tổng số 3165 gen được phân vào 43 lớp con bao gồm 13 lớp con thuộc lớp cấu tạo tế bào (CC), 10 lớp con thuộc lớp liên quan đến phân tử chức năng (MF), và 20 lớp con liên quan đến các quá trình sinh học (BP). Cụ thể, lớp CC chiếm nhiều gen nhất (1638 gen, 45,3%) tiếp theo là lớp BP (1424 gen, 39,4%) và MF ( 553 gen, 15,3%). Các con đường chiếm nhiều nhất là tế bào (GO:0005623; 508 gen), thành phần tế bào (GO:0044464; 379 gen) và cấu tạo thành tế bào (GO:0016020; 340gen). Trong lớp BP 3 nhĩm chiếm ưu thế là quá trình chuyển hĩa (GO:0008152; 378 gen), quá trình trong tế bào (GO:0009987; 379) gen và phát triển (GO:0040007; 281 gen). Trong các lớp nhỏ thuộc vào lớp MF, các gen thuộc nhĩm cĩ hoạt tính xúc tác (GO:0003824) và bám (GO:0005488) chiếm 311 và 176 gen.
Hình 3.23Phân loại chức năng gen
3.5.3. So sánh COG tồn bộ hệ gen và các enzym liên quan đến chuyển hĩa carbonhydrate
Sự tiến hĩa của vi khuẩn là nhờ sự tiến hĩa thẳng và bắt nguồn từ 1 gen tổ tiên duy nhất, từ đĩ tạo thành các gen tiến hĩa thẳng trong các lồi khác nhau, để cĩ thể hiệu rõ hơn về chức năng, cấu tạo cũng như sự biến đổi của các gen thì cần phải cĩ sự so sánh các nhĩm COG ở các chủng khác nhau. Các nhĩm COG của chủng
C. cellulans MP1 được so sánh với của 4 chủng khác gồm J36, LMG16121, và JKA48. Chủng C. cellulans MP1 cĩ 3405 gen thuộc vào các nhĩm COG và 794 gen độc lập. Các chủng J36 và ZKA48 cĩ lần lượt 3604 và 3605 gen thuộc các nhĩm COG, trong khi chủng LMG16121 cĩ ít gen COG nhất (hình 3.25). Trong đĩ thì số gen đơn lẻ lớn nhất thuộc về chủng MP1. Biểu đồ Venn Edward 6 chiều cho thấy rằng cĩ 2539 gen COG được tìm thấy trong cả 4 chủng thuộc chi C. cellulans. Trong số các COG riêng biệt của mỗi chủng thì chủng MP1 cĩ 20 và là số lượng lớn nhất trong 4 chủng. Để kiểm chứng kết quả này, cơng cụ xây dựng cây phân lồi REALPHY đã được sử dụng. Với lựa chọn cây cĩ khả năng xảy ra cao nhất (maximum likelihood), cây phân lồi được xây dựng cho thấy 2 chủng MP1 và LMG16121 tạo thành một nhánh riêng, cho thấy một mối quan hệ tiến hĩa mật thiết (hình 3.24).
Hình 3.24. Cây phân lồi chủng C.cellulans MP1
Sử dụng trang web dbCAN2, các gen được dự đốn tổng hợp các CAZy của chủng C. cellulans MP1 được sàng lọc để tìm ra các gen liên quan đến việc phân hủy cellulose và hemicellulose. Sau khi loại bỏ các trình tự khơng liên quan, 195 vùng gen được dự đốn là CAZy được tìm thấy, chúng chiếm 4,8% trong tổng số 3216 vùng của chủng này. Các enzym glycoside hydrolase (GH) phụ trách việc phân hủy phần lớn sinh khối thực vật (cellulose và hemicellulose) được dự đốn là họ enzym nhiều nhất và chiếm đến 99 enzym. Tiếp theo là 39 enzym glycosyl transferase (GT), 37 đơn vị bám vào carbohydrate (CBM), 11 enzym carbohydrate esterase (CE), 6 enzym với các hoạt tính phụ trợ (AA) và 3 enzym polysaccharide lyases (PL) được phát hiện
Hình 3.25So sánh genom của MP1 với các chủng C.cellulans
Hệ gen của 4 chủng C. cellulans MP1, J36, LMG16121, ZKA48 đã được so sánh. Về cơ bản, số lượng vùng thuộc nhĩm CAZy của chủng MP1 lớn hơn rất nhiều so với các chủng khác (hình 3.25). Các vùng CAZy được tìm thấy trong C. cellulans MP1 cĩ độ tương đồng cao với chủng C. cellulans J36. Mặc dù 2 chủng MP1 và LMG16121 cĩ quan hệ gần gũi, nhưng MP1 sở hữu nhiều hơn chủng LMG16121 56 vùng CAZy. Ngồi chủng LMG16121 các số vùng thuộc vào các họ GT, CBM và AA của các chủng cịn lại gần như là bằng nhau, cho thấy sự tác động đồng thời của các gen vùng này trong quá trình phân hủy sinh khối thực vật
3.5.4. Khai thác các enzym thủy phân sinh khối thực vật từ nguồn gen của chủng C. cellulans MP1.
Phân tích các gen CAZy đã tìm ra 30 gen liên quan đến cellulose trong hệ gen của C. cellulans MP1. Các họ enzym lớn, liên quan đến việc thủy phân cellulose bao gồm GH6, GH9, GH48, GH10, GH16, GH1, GH3, GH13, và GH64. Việc định danh gen đã phát hiện 5 endoglucanase (2 thuộc họ GH6 và 3 thuộc họ GH9), 3 exoglucanases (GH6,GH10, GH48) và lichenase (GH16) tồn tại trong hệ gen của chủng MP1 (bảng 3.17). Trong 8 gen tổng hợp endo và exo glucanase thì 5 gen (Orf_454, Orf_1616, Orf_3244, Orf_1607, Orf_1611) cĩ gắn thêm vùng CBM2 (một vùng cĩ thể bám vào phần tinh thể của các cơ chất cellulose, chitin, xylan). CBM2 là vùng CBM cĩ mặt nhiều nhất trong hệ gen của MP1. Hệ gen của MP1 cịn cĩ các gen quy định 3 enzym thuộc GH1 và GH6, enzym thuộc GH3 cĩ hoạt tính β- glucosidase được xem là gĩp phần quan trọng trong quá trình thủy phân cellulose và 3 enzym khác thuộc họ GH13 cĩ hoạt tính α-glucosidase. Ngồi ra cịn cĩ 2 họ enzym polysaccharide lyase liên quan đến việc phân giải pectin: PL4 (Orf_102) và PL1 (Orf_1326) (Bảng 3.17).
Bảng 3.17Danh mục các cellulase và hemicellulase dự đốnbiểu hiện trên hệ gen của C. cellulans MP1
Phân loại enzym Cellulose- related Hemicellulose- related
Xét về khả năng thủy phân hemicellulose, một số protein được xác định là cĩ tham gia vào quá trình này. Các họ enzym lớn nhất tham gia vào quá trình phá vỡ cấu trúc của hemicellulose là GH43, GH31, GH127, GH51, GH10, GH36, và GH4, và tổng số các enzym được tìm thấy là 21. Trong số đĩ, chiếm nhiều nhất là GH43 (9 enzym), GH124 (3 enzym) và GH31 (2 enzym), điều này cho thấy chủng MP1 cĩ thể cĩ một tiềm năng lớn trong việc thủy phân và cắt các mạch nhánh trong cấu trúc hemicellulose. Các gen này được dự đốn bao gồm: mannan endo-1,4-β-
mannosidase, arabinoxylan arabinofuranohydrolase, α-xylosidase, α-L- arabinofuranosidase, β-L-arabinofuranosidase, endo-1,4-β-xylanase, α- galactosidase, và enzym đa chức năng β-xylosidase/α-arabinosidase. Chỉ cĩ 2 enzym là mannan endo-1,4-β-mannosidase và α-galactosidase đã được chứng minh về khả năng thủy phân mannan, thành phần quan trọng thứ 2 trong hemicellulose. 2 enzym endo-1,4-β-xylanase (Orf_100 và Orf_3772) và 1 enzym đa chức năng β- xylosidase/α-arabinosidase (Orf_3988) được gắn thêm CBM2 và CBM9. Một điều hiếm thấy là các gen mã hĩa các enzym arabinofuranosidase (orf_3999, orf_4000, orf_4001 và orf_4002), arabinoxylan arabinofuranohydrolase (orf_4003), và enzyme đa chức năng β-xylosidase/α-arabinosidase (orf_4004) lại được nhĩm với nhau và nằm trong cùng 1 operon.
Tương tự trong nghiên cứu của Chen và cộng sự (2019), ở nghiên cứu này vi khuẩn Micromonospora sp CP22 cũng cĩ khả năng sinh cellulase, xylanase và mananase được phân lập từ phân ủ của cây cọ dầu. Để đánh giá tiềm năng của chủng vi khuẩn tác giả đã nghiên cứu sâu hơn về bộ gen chủng CP22 bằng phương pháp giải trình tự, chú thích và phân tích bộ gen của vi khuẩn. Kết quả thu được chủng CP22 cĩ kích thước 5826203 bp với hàm lượng G+C là 70,84%. Phân tích chi tiết bộ gen về sự phân hủy lignocellulose cho thấy tổng cộng 60 gen bao gồm 47 gen liên quan đến sự thủy phân glycoside và 16 gen liên quan đến phân cắt liên kết este trong cacbohydrat. Đặc biệt, 20 gen mã hĩa cho cellulase (8 endoglucanase, 3 exoglucanase và 9 β-glucosidase) và 40 gen mã hĩa cho hemicellulose (15 endo- 1,4-β-xylanase, 3β-xylosidase, 3α-arabinofuranosidase, 10 acetyl xylan esterase, 6 polysacharide deacetylase, 1 β-mannanase, 1β-mannosidase và 1 α-galactosidase). Ba mươi gen mã hĩa modun liên kết carbohydrate (CBM). Các CBM này được tìm thấy trong 27 gen phân giải cellulose và hemicellulose, cho thấy vai trị tiềm năng của chúng trong việc tăng cường liên kết với cơ chất của các enzym. Các dữ liệu phân tích bộ gen của chủng CP22 đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc khám phá chủng vi khuẩn cĩ khả năng phân giải lignocellulose gĩp phần ứng dụng cơng nghệ sinh học trong thực tiễn [119].
Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase, xylanase của MP1 đã được chứng minh ở các nghiên cứu phần trên.
Nhận thấy chủng chủng MP1 cĩ hệ enzym phong phú, cĩ tiềm năng lớn trong phân giải các vật liệu giàu cellulose vi vậy chúng tơi tiếp tục thu nhận enzym thơ của chủng MP1 để thực hiện các nghiên cứu khảo sát khả năng thủy phân lignocelluloses của chủng MP1.
3.6. Khảo sát khả năng thủy phân cellulose của rơm sử dụng cellulase thu nhận từ MP1 nhận từ MP1
3.6.1. Xác định thành phần nguyên liệu rơm
Rơm được lấy từ ruộng, ngâm sạch, sấy khơ, xử lý, nghiền nhỏ và xác định thành phần hĩa học
Thành phần hĩa học của rơm gồm cĩ cellulose, hemicellulose, lignin và tro. Trước tiền xử lý các thành phần của rơm xác định được cellulose 38,4%, hemicellulose 26,7% và lignin 13,8% , Tuy nhiên sau tiền xử lý các thành phần này thay đổii đáng kể (bảng 3.27)
Bảng 3.18Một số thành phần hĩa học của rơm trước và sau tiền xử
lý bằng kiềm (% chất khơ nguyên liệu)
Cơ chất Rơm chưa xử lý Rơm đã tiền xử lý bằng NaOH
So sánh với các kết quả về thành phần của rơm do Bernard và cộng sự (2020) đã cơng bố cho thấy tương tự với kết quả chúng tơi xác định [120]. Sau khi tiền xử lý rơm bằng phương pháp kiềm hàm lượng cellulose trong rơm tăng từ 38,4% lên tới 55,3% nhờ quá trình tiền xử lý đã loại bỏ đi một lượng đáng kể hemicellulose và lignin. Với rơm sau tiền xử lý cellulose trở nên thành phần chính trong nguyên liệu chiếm 55,3% [61].
3.6.2. Ảnh hƣởng của tiền xử lý cơ chất tới hiệu suất quá trình thủy phân
Rơm trước và sau tiền xử lý bằng kiềm được sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình thủy phân sử dụng enzym thơ thu nhận từ chủng vi khuẩn
Cellulosimicrobium sp. MP1. Quá trình đường hĩa được thực hiện ở nhiệt độ 50°C với tỷ lệ cơ chất/chất lỏng 1/100 (g/ml), nồng độ enzym 150 U/100ml. Xác định hàm lượng đường khử tạo thành sau 6,18 và 24 giờ thủy phân.
Bảng 3.19Ảnh hưởng của tiền xử lý cơ chất tới hiệu suất đường hĩa Thời gian thủy phân (giờ) 6 18 24 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả bảng 3.19 cho thấy hiệu suất đường hĩa của rơm đã qua tiền xử bằng kiềm cao hơn so với nguyên liệu rơm chưa qua tiền xử lý, cụ thể sau 24 giờ thủy phân hiệu suất đường hĩa với rơm chưa tiền xử lý đạt 30,27% trong khi hiệu suất đường hĩa của rơm đã qua tiền xử lý cao gấp 1,8 lần đạt 55,5%.
3.6.3. Ảnh hƣởng các yếu tố tới hiệu suất thủy phân bởi enzym
Đối với phản ứng enzym thơng thường khi kéo dài thời gian thủy phân thì hiệu suất đường hĩa tăng, tuy nhiên đến một thời điểm nhất định nếu tiếp tục kéo dài thời gian thì lượng sản phẩm tạo thành khơng tăng nữa, thậm chí bị giảm do ảnh hưởng của các yếu tố gây tổn thất sản phẩm. Thí nghiệm xác định thời điểm kết thúc phản ứng đươc khảo sát từ 0 giờ đến 72 giờ, kết quả cho thấy sau 24 giờ lượng đường khử tạo thành tăng chậm và đạt hàm lượng cao nhất sau 48 đến 72 giờ thủy phân. Từ 48 đến 72 giờ lượng đường tăng lên khơng đáng kể vì vậy lựa chọn 48 giờ là thời gian thủy phân thích hợp nhất, hiệu suất đường hĩa đạt được sau 48 giờ đạt 66,87%.
Bảng 3.20Ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất đường hĩa
Thời gian thủy phân (giờ) 0 6 18 24 48 72
Kết quả tương tự cũng được cơng bố bởi Chiranjeevi và cộng sự, trong đĩ lượng đường khử tạo thành cao nhất sau 48 giờ thủy phân và sau 48 giờ lượng khử tăng lên khơng đáng kể [62].
Quá trình thủy phân cơ chất đã qua tiền xử lý và cơ chất chưa tiền xử lý được tiến hành ở các nhiệt độ khác nhau từ 40°C đến 70°C với nồng độ cơ chất là 1% và thời gian thủy phân 48 giờ. Kết quả thể hiện ở bảng 3.21
Bảng 3.21Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất đường hĩa
Nhiệt độ (ºC)
40 50 60 70
Kết quả bảng 3.21 cho thấy hiệu suất đường hĩa đạt cao nhất đạt 66,87% khi điều chỉnh nhiệt độ thủy phân ở 50°C. Do đĩ 50°C là nhiệt độ tối ưu của quá trình thủy phân bởi enzym thu nhận từ Cellulosimicrobium sp. MP1
Nồng độ cơ chất quyết định mức độ tiếp xúc enzym cơ chất từ đĩ ảnh hưởng tới hiệu suất quá trình đường hĩa. Nghiên cứu được tiến hành bằng cách thay đổi tỷ lệ chất rắn và chất lỏng trong phản ứng. Kết quả thể hiện ở bảng 3.22
Bảng 3.22Ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn/lỏng tới hiệu suất đường hĩa
Tỷ lệ chất rắn/lỏng (g/mL)
Khi tăng tỷ lệ cơ chất trong dung dịch thì lượng đường khử tăng lên và đạt cao nhất khi tỷ lệ cơ chất/dung dịch 3/100. Tuy nhiên hiệu suất đường hố lại đạt cao hơn ở tỷ lệ 1/100 và 2/100 và do ở 2 tỷ lệ này hiệu suất đường hĩa gần như nhau vì vậy tỷ lệ 2/100 là tỷ lệ cơ chất/dung dịch đem lại hiệu quả nhất cho quá trình đường hĩa. Tương tự như báo cáo Chiranjeevi và cộng sự [62], điều này cĩ thể giải thích rằng tỷ lệ cơ chất cao cũng kìm hãm sự hoạt động của enzym.
Bảng 3.23Ảnh hưởng của nồng độ enzym tới hiệu suất đường hĩa Nồng độ enzym (U/g) 7,5 15 30 37,5 75
Trong phản ứng enzym, vận tốc phản ứng thường tỷ lệ thuận với nồng độ enzym do đĩ nếu tăng nồng độ enzym trong phản ứng vận tốc phản ứng tăng lên đương nhiên hiệu suất đường hĩa tăng. Tuy nhiên khi nồng độ enzym đủ lớn nếu ta tiếp tục tăng nồng độ enzym thì hiệu suất đường hĩa khơng cịn tăng nữa. Kết quả nghiên cứu nồng độ enym phù hợp cho quá trình thủy phân được tiến hành bằng cách thay đổi nồng độ enzym trong dung dịch từ 7,5 U/ml đến 75U/ml kết quả thu được ở bảng sau
pH khơng những ảnh hưởng tới hoạt độ enzym mà cịn ảnh hưởng tới cấu trúc của cơ chất. Nghiên cứu về enzym từ Cellulosimicrobium chỉ ra mặc dù điều kiện pH kiềm yếu khơng phải là pH tối ưu của cellulase và xylanase (pH tối ưu hai enzym này trong nghiên cứu là khoảng 5,2-6,0), nhưng hơn 50% hoạt tính cellulase và 70% hoạt tính xylanase so với hoạt tính cao nhất vẫn được duy trì trong điều kiện kiềm đến hơn 120 giờ [12]. Do đĩ nhiều trường hợp pH thích hợp nhất chưa hẳn là pH tối ưu của enzym
Bảng 3.24Ảnh hưởng của pH tới hiệu suất đường hĩa
pH 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
Kết quả cho thấy hàm lượng đường khử tăng trong khoảng pH từ 5,0 đến 7,0 và đạt giá trị cao nhất tại giá trị pH 5,5 đến 6,0. Hàm lượng đường khử tạo thành
giảm nhẹ khi tăng pH đến 6,5 và 7,0 cho thấy khoảng pH hoạt động của cellulase thu nhận từ Cellulosimicrobum sp MP1 là tương đối rộng từ pH 5,0 đên 7,0
Các nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình đường hĩa cho thấy hiệu suất đường hĩa cao nhất đạt 69,91 % tại nhiệt độ đường hĩa 55°C, thời gian đường hĩa 48 giờ, nồng độ cơ chất trong dung dịch 2g/100ml, nồng độ enzym 37,5 U/g và pH 5,5.
Kết quả này được so sánh với cơng bố của Iram và cộng sự, các tác giả đã phân lập được chủng thuộc chi Cellulomonas từ ruột mối và đã sử dụng enzym từ chủng này cho quá trình thủy phân các vật liệu cellulose như thân cây ngơ và rơm, kết quả cho thấy khi thủy phân thân cây ngơ hàm lượng đường khử thu được cao hơn so với thủy phân rơm và đạt 18,9 mM/l tương đương với 3,4 g/l [58]. Hàm lượng đường thu được này thấp hơn so với kết quả nghiên cứu trên tuy nhiên nghiên cứu của Iram và cộng sự sử dụng nguyên liệu chưa qua tiền xử lý và chưa tối ưu hĩa các điều kiện tối ưu.
Để biết được các sản phẩm cụ thể của quá trình thủy phân chúng tơi tiến hành phân tích hàm lượng đường glucose, xylose, cellobiose trong dịch thủy phân bằng HPLC.
Kết quả phân tích sản phẩm thủy phân bằng HPLC như Hình 3.26.
A: Mẫu đối chứng (Dịch thủy phân bởi enzym đã bị bất hoạt tương ứng)
B: Hàm lượng đường trong dịch thủy phân rơm đã tiền xử lý
Hình 3.26.Sản phẩm thủy phân rơm sử dụng cellulase từ MP1 bằng HPLC
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});