Rơm được lấy từ ruộng, ngâm sạch, sấy khơ, xử lý, nghiền nhỏ và xác định thành phần hĩa học
Thành phần hĩa học của rơm gồm cĩ cellulose, hemicellulose, lignin và tro. Trước tiền xử lý các thành phần của rơm xác định được cellulose 38,4%, hemicellulose 26,7% và lignin 13,8% , Tuy nhiên sau tiền xử lý các thành phần này thay đổii đáng kể (bảng 3.27)
Bảng 3.18Một số thành phần hĩa học của rơm trước và sau tiền xử
lý bằng kiềm (% chất khơ nguyên liệu)
Cơ chất Rơm chưa xử lý Rơm đã tiền xử lý bằng NaOH
So sánh với các kết quả về thành phần của rơm do Bernard và cộng sự (2020) đã cơng bố cho thấy tương tự với kết quả chúng tơi xác định [120]. Sau khi tiền xử lý rơm bằng phương pháp kiềm hàm lượng cellulose trong rơm tăng từ 38,4% lên tới 55,3% nhờ quá trình tiền xử lý đã loại bỏ đi một lượng đáng kể hemicellulose và lignin. Với rơm sau tiền xử lý cellulose trở nên thành phần chính trong nguyên liệu chiếm 55,3% [61].
3.6.2. Ảnh hƣởng của tiền xử lý cơ chất tới hiệu suất quá trình thủy phân
Rơm trước và sau tiền xử lý bằng kiềm được sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình thủy phân sử dụng enzym thơ thu nhận từ chủng vi khuẩn
Cellulosimicrobium sp. MP1. Quá trình đường hĩa được thực hiện ở nhiệt độ 50°C với tỷ lệ cơ chất/chất lỏng 1/100 (g/ml), nồng độ enzym 150 U/100ml. Xác định hàm lượng đường khử tạo thành sau 6,18 và 24 giờ thủy phân.
Bảng 3.19Ảnh hưởng của tiền xử lý cơ chất tới hiệu suất đường hĩa Thời gian thủy phân (giờ) 6 18 24
Kết quả bảng 3.19 cho thấy hiệu suất đường hĩa của rơm đã qua tiền xử bằng kiềm cao hơn so với nguyên liệu rơm chưa qua tiền xử lý, cụ thể sau 24 giờ thủy phân hiệu suất đường hĩa với rơm chưa tiền xử lý đạt 30,27% trong khi hiệu suất đường hĩa của rơm đã qua tiền xử lý cao gấp 1,8 lần đạt 55,5%.
3.6.3. Ảnh hƣởng các yếu tố tới hiệu suất thủy phân bởi enzym
Đối với phản ứng enzym thơng thường khi kéo dài thời gian thủy phân thì hiệu suất đường hĩa tăng, tuy nhiên đến một thời điểm nhất định nếu tiếp tục kéo dài thời gian thì lượng sản phẩm tạo thành khơng tăng nữa, thậm chí bị giảm do ảnh hưởng của các yếu tố gây tổn thất sản phẩm. Thí nghiệm xác định thời điểm kết thúc phản ứng đươc khảo sát từ 0 giờ đến 72 giờ, kết quả cho thấy sau 24 giờ lượng đường khử tạo thành tăng chậm và đạt hàm lượng cao nhất sau 48 đến 72 giờ thủy phân. Từ 48 đến 72 giờ lượng đường tăng lên khơng đáng kể vì vậy lựa chọn 48 giờ là thời gian thủy phân thích hợp nhất, hiệu suất đường hĩa đạt được sau 48 giờ đạt 66,87%.
Bảng 3.20Ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất đường hĩa
Thời gian thủy phân (giờ) 0 6 18 24 48 72
Kết quả tương tự cũng được cơng bố bởi Chiranjeevi và cộng sự, trong đĩ lượng đường khử tạo thành cao nhất sau 48 giờ thủy phân và sau 48 giờ lượng khử tăng lên khơng đáng kể [62].
Quá trình thủy phân cơ chất đã qua tiền xử lý và cơ chất chưa tiền xử lý được tiến hành ở các nhiệt độ khác nhau từ 40°C đến 70°C với nồng độ cơ chất là 1% và thời gian thủy phân 48 giờ. Kết quả thể hiện ở bảng 3.21
Bảng 3.21Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất đường hĩa
Nhiệt độ (ºC)
40 50 60 70
Kết quả bảng 3.21 cho thấy hiệu suất đường hĩa đạt cao nhất đạt 66,87% khi điều chỉnh nhiệt độ thủy phân ở 50°C. Do đĩ 50°C là nhiệt độ tối ưu của quá trình thủy phân bởi enzym thu nhận từ Cellulosimicrobium sp. MP1
Nồng độ cơ chất quyết định mức độ tiếp xúc enzym cơ chất từ đĩ ảnh hưởng tới hiệu suất quá trình đường hĩa. Nghiên cứu được tiến hành bằng cách thay đổi tỷ lệ chất rắn và chất lỏng trong phản ứng. Kết quả thể hiện ở bảng 3.22
Bảng 3.22Ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn/lỏng tới hiệu suất đường hĩa
Tỷ lệ chất rắn/lỏng (g/mL)
Khi tăng tỷ lệ cơ chất trong dung dịch thì lượng đường khử tăng lên và đạt cao nhất khi tỷ lệ cơ chất/dung dịch 3/100. Tuy nhiên hiệu suất đường hố lại đạt cao hơn ở tỷ lệ 1/100 và 2/100 và do ở 2 tỷ lệ này hiệu suất đường hĩa gần như nhau vì vậy tỷ lệ 2/100 là tỷ lệ cơ chất/dung dịch đem lại hiệu quả nhất cho quá trình đường hĩa. Tương tự như báo cáo Chiranjeevi và cộng sự [62], điều này cĩ thể giải thích rằng tỷ lệ cơ chất cao cũng kìm hãm sự hoạt động của enzym.
Bảng 3.23Ảnh hưởng của nồng độ enzym tới hiệu suất đường hĩa Nồng độ enzym (U/g) 7,5 15 30 37,5 75
Trong phản ứng enzym, vận tốc phản ứng thường tỷ lệ thuận với nồng độ enzym do đĩ nếu tăng nồng độ enzym trong phản ứng vận tốc phản ứng tăng lên đương nhiên hiệu suất đường hĩa tăng. Tuy nhiên khi nồng độ enzym đủ lớn nếu ta tiếp tục tăng nồng độ enzym thì hiệu suất đường hĩa khơng cịn tăng nữa. Kết quả nghiên cứu nồng độ enym phù hợp cho quá trình thủy phân được tiến hành bằng cách thay đổi nồng độ enzym trong dung dịch từ 7,5 U/ml đến 75U/ml kết quả thu được ở bảng sau
pH khơng những ảnh hưởng tới hoạt độ enzym mà cịn ảnh hưởng tới cấu trúc của cơ chất. Nghiên cứu về enzym từ Cellulosimicrobium chỉ ra mặc dù điều kiện pH kiềm yếu khơng phải là pH tối ưu của cellulase và xylanase (pH tối ưu hai enzym này trong nghiên cứu là khoảng 5,2-6,0), nhưng hơn 50% hoạt tính cellulase và 70% hoạt tính xylanase so với hoạt tính cao nhất vẫn được duy trì trong điều kiện kiềm đến hơn 120 giờ [12]. Do đĩ nhiều trường hợp pH thích hợp nhất chưa hẳn là pH tối ưu của enzym
Bảng 3.24Ảnh hưởng của pH tới hiệu suất đường hĩa
pH 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
Kết quả cho thấy hàm lượng đường khử tăng trong khoảng pH từ 5,0 đến 7,0 và đạt giá trị cao nhất tại giá trị pH 5,5 đến 6,0. Hàm lượng đường khử tạo thành
giảm nhẹ khi tăng pH đến 6,5 và 7,0 cho thấy khoảng pH hoạt động của cellulase thu nhận từ Cellulosimicrobum sp MP1 là tương đối rộng từ pH 5,0 đên 7,0
Các nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình đường hĩa cho thấy hiệu suất đường hĩa cao nhất đạt 69,91 % tại nhiệt độ đường hĩa 55°C, thời gian đường hĩa 48 giờ, nồng độ cơ chất trong dung dịch 2g/100ml, nồng độ enzym 37,5 U/g và pH 5,5.
Kết quả này được so sánh với cơng bố của Iram và cộng sự, các tác giả đã phân lập được chủng thuộc chi Cellulomonas từ ruột mối và đã sử dụng enzym từ chủng này cho quá trình thủy phân các vật liệu cellulose như thân cây ngơ và rơm, kết quả cho thấy khi thủy phân thân cây ngơ hàm lượng đường khử thu được cao hơn so với thủy phân rơm và đạt 18,9 mM/l tương đương với 3,4 g/l [58]. Hàm lượng đường thu được này thấp hơn so với kết quả nghiên cứu trên tuy nhiên nghiên cứu của Iram và cộng sự sử dụng nguyên liệu chưa qua tiền xử lý và chưa tối ưu hĩa các điều kiện tối ưu.
Để biết được các sản phẩm cụ thể của quá trình thủy phân chúng tơi tiến hành phân tích hàm lượng đường glucose, xylose, cellobiose trong dịch thủy phân bằng HPLC.
Kết quả phân tích sản phẩm thủy phân bằng HPLC như Hình 3.26.
A: Mẫu đối chứng (Dịch thủy phân bởi enzym đã bị bất hoạt tương ứng)
B: Hàm lượng đường trong dịch thủy phân rơm đã tiền xử lý
Hình 3.26.Sản phẩm thủy phân rơm sử dụng cellulase từ MP1 bằng HPLC
Kết quả xác định hàm lượng đường khử cũng như kết quả kiểm tra dải sản phẩm thủy phân bằng HPLC cho thấy trong các thành phần tạo thành của quá trình thủy phân cĩ xuất hiện các pick của các đường đơn glucose, xylose và đường đơi cellobiose, điều này cho thấy hệ enzym chủng vi khuẩn MP1 cĩ khả năng phân giải
cellulose và hemicellulose đến sản phẩm cuối cùng. Kết quả này cũng được chứng minh khi phân tích hệ gen vi khuẩn MP1 cho thấy chủng này cĩ đến 30 gen mã hĩa cho các enzym phân giải hemicellulose gần như cĩ đầy đủ các enzym thuộc họ GH cho thấy MP1 là chủng cĩ tiềm năng trong việc phân giải lignocellulose.
KẾT LUẬN
Qua quá trình nghiên cứu chúng tơi thu đƣợc các kết quả nhƣ sau:
- Đã phân lập 108 chủng vi khuẩn từ các mẫu mối lấy từ các địa điểm khác nhau, chọn ra được 11 chủng vi khuẩn cĩ hoạt tính cellulase cao từ kết quả định tính và định lượng. Định tên được 9 chủng vi khuẩn, trong đĩ cĩ tới 7/11 chủng thuộc chi Bacillus chiếm 63%.
- Tối ưu quá trình sinh tổng hợp CMCase từ Bacillus subtilis G4 trên mơi trường cĩ nồng độ casein 19,92 g/l, nồng độ bột đậu tương 15,9 g/l, nồng độ tinh bột 19,52 g/l, nuơi cấy ở nhiệt độ 37°C, pH 7,0, thời gian 72 giờ, tỷ lệ nhân giống 1% và tốc độ lắc 150 vịng/phút đạt hoạt độ endoglucanase cao nhất 5,63 U/ml. Chế phẩm cellulase kết tủa bởi 80% Acetone cĩ nhiệt độ tối ưu 60ºC, pH tối ưu 7,0; bền ở pH từ 4,0-7,0 và bền nhiệt từ 40ºC - 50ºC.
- Thu nhận được cellulase từ MP1 cĩ hoạt độ endoglucanase cao nhất đạt 3,25 U/ml trên mơi trường cĩ nồng độ tinh bột 1%, casein 1%, bột đậu tương 1,5 % , thời gian nuơi cấy 72 giờ, tỷ lệ giống 5%, tốc độ lắc 100 vịng/phút, pH mơi trường 7.5 và nhiệt độ 37ºC. Chế phẩm cellulase thu nhận từ MP1 kết tủa bằng ethanol cĩ nhiệt độ và pH tối ưu tương ứng là 60ºC và pH 6.0, cellulase từ MP1 bền ở nhiệt độ 40ºC-50ºC và bền pH từ 5-10.
+ Đã giải trình tự tồn bộ hệ gen, lắp ráp, chú giải và phân tích các gen vi khuẩn Cellulosimicrobium. cellulans MP1 cho kết quả: hệ gen cĩ kích thước 4.580.230 bp gồm 23 contig, chứa 3.964 trình tự mã hĩa protein (CDC), tìm ra được 30 gen cĩ liên quan đến cellulase và 21 gen liên quan đến hemicelluase trong hệ gen để chứng minh cho khả năng phân giải lignocellulose của chủng.
+ Khảo sát khả năng thủy phân cellulose của rơm sử dụng cellulase thu nhận từ MP1 thu được hiệu suất đường hĩa cao nhất đạt 69,91 % tại nhiệt độ đường hĩa 55°C, thời gian đường hĩa 48 giờ, nồng độ cơ chất trong dung dịch 2g/100ml, nồng độ enzym 37,5 U/g và pH 5,5
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] M. K. Bhat (2000), “Cellulases and related enzymes in biotechnology”
Biotechnol. Adv, Vol. 18, No. 5, pp. 355–38.
[2] S. E. Hobdey, B. S. Donohoe, R. Brunecky, M. E. Himmel, and Y. J. Bomble (2015), “New Insights into Microbial Strategies for Biomass Conversion,”
Direct Microb. Convers. Biomass to Adv. Biofuels, pp. 111–127
[3] Y. Lee, H. Kim, M. J. Cho, K. Shin, Y. Kim, and Y. Kim (2010), “Cellulose Hydrolysis by Digestive Enzymes of Reticulitermes speratus, a Native
Termite from Korea ” Vol. 38, No. 2, pp. 140–148.
[4] G. M. Mathew, R. K. Sukumaran, R. R. Singhania, and A. Pandey (2008), “Progress in research on fungal cellulases for lignocellulose degradation,” J. Sci. Ind. Res. (India), Vol. 67, No. 11, pp. 898–907.
[5] J. Duan, J. Liu, X. Ma, Y. Zhang, X. Wang, and K. Zhao (2017), “Isolation, identification, and expression of microbial cellulases from the gut of
Odontotermes formosanus,” J. Microbiol. Biotechnol., Vol. 27, No. 1, pp. 122–129.
[6] M.-J. Cho, Y.-H. Kim, K. Shin, Y.-K. Kim, Y.-S. Kim, and T.-J. Kim (2010) , “Symbiotic adaptation of bacteria in the gut of Reticulitermes speratus: low endo-beta-1,4-glucanase activity.,” Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 395, No. 3, pp. 432–435.
[7] M. Morrison, P. B. Pope, S. E. Denman, and C. S. McSweeney (2009), “Plant biomass degradation by gut microbiomes: more of the same or something new?,” Curr. Opin. Biotechnol., Vol. 20, No. 3, pp. 358–363.
[8] A. Bakalidou, P. Kämpfer, M. Berchtold, T. Kuhnigk, M. Wenzel, and H. Kưnig (2002), “Cellulosimicrobium variabile sp. nov., a cellulolytic bacterium from the hindgut of the termite Mastotermes darwiniensis,” Int. J. Syst. Evol. Microbiol., Vol. 52, No. 4, pp. 1185–1192.
[9] M. Wenzel, I. Schưnig, M. Berchtold, P. Kämpfer, and H. Kưnig (2002), “Aerobic and facultatively anaerobic cellulolytic bacteria from the gut of the termite Zootermopsis angusticollis.,” J. Appl. Microbiol., Vol. 92, No. 1, pp. 32–40.
[10] J.-H. Chou, W.-M. Chen, A. B. Arun, and C.-C. Young (2007), “Trabulsiella odontotermitis sp. nov., isolated from the gut of the termite Odontotermes formosanus Shiraki.,” Int. J. Syst. Evol. Microbiol., vol. 57, No. Pt 4, pp. 696– 700.
[11] R. H. Doi (2015), “Cellulases of mesophilic microorganisms (2008): cellulosome and noncellulosome producers.,” Ann. N. Y. Acad. Sci., vol. 1125, pp. 267–279.
[12] W. Liu et al (2015), “Bioflocculant production from untreated corn stover using Cellulosimicrobium cellulans L804 isolate and its application to harvesting microalgae,” Biotechnol. Biofuels, Vol. 8, No. 1, pp. 1–12.
[13] M. Irfan, A. Safdar, Q. Syed, and M. Nadeem (2012), "Isolation and Screening of cellulotic Bacteria from soil and optimization of cellulase production and activity" Turkish J. Biochem., vol. 37, no. 3, pp. 287–293. [14] D. Submitted et al. (2013), “Production of lignocellulosic ethanol from
Lantana camara by bacterial cellulase of termite symbionts Departerment of Life Science,”.
[15] B. A.D, G. Apurv, G. Malarvili, S. Rameez, and K. Bhushan (2014), “Exploration of cellulolytic potential of Termite gut flora for sustainable development,” IOSR J. Environ. Sci. Toxicol. Food Technol., Vol. 8, No. 2, pp. 71–76.
[16] P. Nisha (2015), “Cellulase Production Optimization Using Cellulolytic Bacteria,” Int. J. Pharm. Chem. Biol. Sci., vol. 5, no. 1, pp. 262–266
[17] N. M. Giang, D. T. Huyen, and T. N. Hai (2016), “In Silico mining for Alkaline enzyme from Metagenomic DNA data of Gut Microbes of the Lower Termite Coptotermes gestroi in Viet Nam”, Acadermia Journal of Biology, 38 (3), pp. 374-383.
[18] J.-M. Song and D.-Z. Wei (2010), “Production and characterization of cellulases and xylanases of Cellulosimicrobium cellulans grown in pretreated and extracted bagasse and minimal nutrient medium M9,” Biomass and Bioenergy, vol. 34, no. 12, pp. 1930–1934..
[19] S. Sreedevi, S. Sajith, and S. Benjamin (2013), “Cellulase Producing Bacteria from the Wood-Yards on Kallai River Bank,” Adv. Microbiol., vol. 03, no. 04, pp. 326–332.
[20] Z. Jaradat, A. Dawagreh, Q. Ababneh, and I. Saadoun (2008), “Influence of Culture Conditions on Cellulase Production by Streptomyces Sp. (Strain J2),”
Jordan J. Biol. Sci., vol. 1, no. 4, pp. 141–146.
[21] A. Vyas, C. Putatunda, J. Singh, and D. Vyas (2016), “Cellulase production by Bacillus subtilis M1 using pretreated groundnut shell based liquid state fermentation,” Biotropia (Bogor)., vol. 23, no. 1, pp. 28–34.
[22] A. P. Nandimath, K. R. Kharat, S. G. Gupta, and A. S. Kharat (2016), “Optimization of cellulase production for Bacillus sp . and Pseudomonas sp . soil isolates,” vol. 10, no. 13, pp. 410–419.
[23] A. Das, S. Bhattacharya, and L. Murali (2010), “Production of cellulase from a thermophilic Bacillus sp. isolated from cow dung,” Am. J. Agric. Environ. Sci, vol. 9, no. 6, pp. 685–691.
[24] J. Luis Sanchez, D. B. Hodge, M. F. Davis, G. Pặs, and A. Zoghlami (2019), “Lignocellulosic Biomass: Understanding Recalcitrance and Predicting Hydrolysis,” Front. Chem. | www.frontiersin.org, vol. 7, p. 874.
[25] C. Sreena, N. Resna, and D. Sebastian (2015), “Isolation and Characterization of Cellulase Producing Bacteria from the Gut of Termites (Odontotermes and Heterotermes Species),” Br. Biotechnol. J., vol. 9, no. 1, pp. 1–10.
[26] D. B. Wilson and D. C. Irwin (1999), “Genetics and Properties of Cellulases,” no. May, pp. 1–21.
[27] E. E. Hafez, C. Of, and T. Applications (2017), “Partial Purification and Characterization of Two Endo- β -1 , 4-glucanase from Trichoderma sp . ( Shmosa tri ),” no. October 2010.
[28] T. M. Wood and V. Garcia-Campayo (1990), “Enzymology of cellulose degradation,” Biodegradation, vol. 1, no. 2, pp. 147–161.
[29] P. Eggleton (2000), “Chapter 1 Taxonomy and Phylogeny of Termites ,” no. Table 1, pp. 1–2.
[30] G. Tokuda, H. Watanabe, T. Matsumoto, and H. Noda (1997), “Cellulose digestion in the wood-eating higher termite, nasutitermes takasagoensis (shiraki): Distribution of cellulases and properties of endo-β-1,4-glucanase,”
Zoolog. Sci., vol. 14, no. 1, pp. 83–93.
[31] A. Brune, “Symbiotic digestion of lignocellulose in termite guts,” Nat. Rev. Microbiol., vol. 12, no. 3, pp. 168–180, 2014, doi: 10.1038/nrmicro3182. [32] M. Ohkuma (2003), “Termite symbiotic systems: efficient bio-recycling of
lignocellulose,” Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 61, no. 1, pp. 1–9. [33] A. Varm, B. K. Kolli, J. Paul, S. Saxena, and H. Kưnig (1994),
“Lignocellulose degradation by microorganisms from termite hills and termite guts: A survey on the present state of art,” FEMS Microbiol. Rev., vol. 15, no. 1, pp. 9–28.
[34] S. Sreeremya, S. Nishaa, and P. Rajiv (2016), “Optimization of Conditions and Production of Carboxy Methyl Cellulase by Bacteria Isolated from Higher Termite Soil,” J. Bioprocess. Biotech., vol. 6, no. 2, pp. 6–9.
[35] N. Academy, N. Academy, and U. States (1923), “Symbiosis between Termites and their Intestinal Protozoa Author ( s ): L . R . Cleveland Source : Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Published by : National Academy of Sciences Stable,” vol. 9, no. 12, pp. 424– 428.
[36] T. Inoue, K. Murashima, J.-I. Azuma, A. Sugimoto, and M. Slaytor (1997), “Cellulose and Xylan Utilisation in the Lower Termite Reticulitermes speratus,” J. Insect Physiol., vol. 43, no. 3, pp. 235–242.
[37] C. Husseneder, B. R. Wise, D. Higashiguchi, C. Lee, and W. H. Robinson (2005), “Microbial diversity in the termite gut: a complementary approach combining culture and culture-independent techniques.,”.
[38] Y. Hongoh et al. (2006), “Phylogenetic diversity, localization, and cell morphologies of members of the candidate phylum TG3 and a subphylum in the phylum Fibrobacteres, recently discovered bacterial groups dominant in termite guts,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 72, no. 10, pp. 6780–6788. [39] A. Vi (2019), “Đánh giá sự đa dạng vi khuẩn cĩ khả năng phân hủy cellulose
và hemicellulose trong ruột mối Coptotermes Gestroi cư trú tại Miền Bắc,” Tạp chí Cơng nghệ sinh học, Tập17, Số. 3, 537–544.
[40] H. R. K. Ali, N. F. Hemeda, and Y. F. Abdelaliem (2019), “Symbiotic cellulolytic bacteria from the gut of the subterranean termite Psammotermes hypostoma Desneux and their role in cellulose digestion,” AMB Express, vol. 9, no. 1.
[41] Z. Bashir et al.( 2013), “Diversity and functional significance of cellulolytic microbes living in termite, pill-bug and stem-borer guts,” Sci. Rep., vol. 3, no. 1, p. 2558..
[42] A. Ferbiyanto, I. Rusmana, and R. Raffiudin (2015), “Characterization and Identification of Cellulolytic Bacteria from gut of Worker Macrotermes gilvus,” HAYATI J. Biosci., vol. 22, no. 4, pp. 197–200.
[43] Z. Pourramezan, G. R. Ghezelbash, B. Romani, S. Ziaei, and A. Hedayatkhah