Cân chính xác 5g rơm cho vào cốc sạch, khơ đã biết khối lượng trước. Đưa mẫu vào tủ sấy và sấy ở 105ºC đến khối lượng khơng đổi. Sau khi sấy lấy mẫu ra cho vào bình hút ẩm để làm nguội, cân. Tiếp tục sấy đến khối lượng khơng đổi. Khi kết quả giữa 2 lần cân cuối cùng cĩ sai số ± 0,5 là coi như khối lượng khơng đổi.
X(%) =
Trong đĩ: m1: Khối lượng mẫu trước khi sấy m2: Khối lượng mẫu sau khi sấy
m: Khối lượng mẫu trước khi sấy
2.5.4. Xác định hàm lƣợng cellulose
Mẫu được nghiền nhỏ thích hợp, sau đĩ xử lý lần lượt bằng dung dịch axit sulfuric và dung dịch natrihydroxit đun sơi. Cặn được tách bằng cách lọc, rửa, sấy khơ, cân sau đĩ tro hĩa. Sự hao hụt khối lượng sau khi tro hĩa được gọi là cellulose [90]
Cân 2 - 3g mẫu cho vào bình hình cầu dung tích 1 lit, thêm vào 200ml dung dịch H2SO4 1,5%, lắp sinh hàn sau đĩ gia nhiệt đến sơi trong khoảng 30 phút. Lọc dung dịch qua giấy lọc và rửa lại nhiều lần bằng nước cất đun sơi cho đến khi khơng cịn axit, dùng giấy pH để thử. Tiếp tục dùng 200ml dung dịch NaOH nồng độ khoảng 2-5% và gia nhiệt đến sơi trong vịng 30 phút để tiếp tục thủy phân. Thêm 2- 3 giọt chất chống tạo bọt và tiến hành quá trình như xử lý. Lọc dung dịch sau đĩ rửa bã nhiều lần bằng nước cất và HCl 1% đến khi hết kiềm, dùng giấy pH để thử.
Chuyển tồn bộ xơ bã vào một chén nung đã sấy khơ, cân bì. Sấy chén cĩ xơ bã trong tủ sấy ở nhiệt độ 1050C trong 1 giờ, để nguội, cân. Sấy lại cho đến khối lượng khơng đổi.
Chuyển chén nung vào lị nung, nung đến tro trắng, làm nguội trong bình hút ẩm, cân. Nung đến khối lượng khơng đổi.
Hàm lượng cellulose thơ cịn được tính bằng % theo khối lượng chất khơ như sau:
X(%) =
Trong đĩ:
Mo – Khối lượng của mẫu, tính bằng g;
M1 - khối lượng chất xơ và cặn sau khi sấy, tính bằng g;
M2 – Khối lượng chất xơ và cặn sau khi đốt nĩng trong lị nung, tính bằng g Wo - Hàm lượng chất khơ của mẫu, biểu thị theo %
Kết quả là trung bình cộng của kết quả 2 lần xác định song song, tính chính xác đến 0,01%.
Cân 0,3g mẫu vào ống nghiệm, ghi lại khối lượng mẫu (chính xác đến 0,1mg). Thêm 3ml NaOH 2M, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ nhàng sau đĩ để luơn đũa trong ống. Ủ 30°C, 60±5 phút. Mỗi 5-10 phút lại khuấy 1 lần, chú ý khơng nhấc đũa ra khỏi ống nghiệm.
Chuẩn bị các mẫu đối chứng đường (glucose, xylose, galacyose, arabinose, mannose) cĩ nồng độ gần nhất với nồng độ ước tính cĩ trong mẫu phân tích để hiệu chỉnh lượng đường bị phân hủy trong quá trình thủy phân bằng kiềm. Pha 10ml dung dịch đường với nồng độ yêu cầu, thêm 348µl NaOH 2M. Chuyển sang các ống nghiệm thủy tinh và đậy kín. Hấp 121°C, 1h các mẫu đường đối chứng và mẫu phân tích sau đĩ để nguội tự nhiên.
Xác định hàm lượng lignin khơng tan trong kiềm(AIL)
Nung chén ở 575±25°C đến khối lượng khơng đổi (sai lệch khối lượng khơng vượt quá 0.3mg sau 60 phút nung), ghi lại khối lượng chén.
Sấy giấy lọc khơng tro ở 105°C đến khối lượng khơng đổi, ghi lại khối lượng mo. Lọc dịch thủy phân thu được ở bước giấy lọc khơng tro với hệ thống hút chân khơng. Thu khoảng 50ml dịch lọc vào falcon để xác định hàm lượng lignin khơng tan trong acid và carbonhydrate. Mẫu dịch cĩ thể bảo quản tối đa 2 tuần trong vịng 6h kể từ khi kết thúc quá trình thủy phân.
Dùng 50ml nước deion để rửa phần bã cịn lại trên giấy lọc. Dùng nước nĩng cĩ thể giúp quá trình lọc diễn ra nhanh hơn.
Sấy phần rắn đến khối lượng khơng đổi, ít nhất 4h ở 105°C. (khối lượng sau sấy là m1=khối lượng giấy lọc + khối lượng lignin khơng tan trong kiềm + khối lượng tro khơng tan trong kiềm). Chuyển tồn bộ giấy lọc khơng tro và bã sau sấy vào chén nung đã biết trước khối lượng. Nung ở 600°C ± trong 24h ± 6h đến khối lượng khơng đổi (khối lượng sau nung là m2 = khối lượng chén nung + khối lượng tro khơng tan trong kiềm).
Lượng tro khơng tan trong kiềm: mAIR = m2 - m chén nung (g)
Lượng lignin khơng tan trong kiềm: mail =m1 - mgiấy lọc - mAIR (g)
Hàm lượng lignin khơng tan trong kiềm của nguyên liệu đã trích ly: %AIL=100×mAIL / mo
Với:
Mo (g) là khối lượng khơ tuyệt đối của nguyên liệu đem đi phân tích M1 (g) là tổng khối lượng sau khi sấy ở 105°C
Phân tích hàm lượng lignin tan trong kiềm(ASL)
Sử dụng máy đo UV-VIS, set blank bằng nước deion hoặc NaOH
Đo mẫu dịch lọc thu được ở bước sĩng thích hợp, chú ý pha lỗng bằng chính dung dịch set blank sao cho giá trị độ hấp thụ nằm trong khoảng 0.7 đến 1.0
Hàm lượng lignin tan trong kiềm của nguyên liệu đã trích ly: %ASL = (100×OD×V dịch lọc×F) / ( ε ×λ× m )
Trong đĩ :
OD: giá trị độ hấp phụ trung bình của ít nhất 2 lần đo (sai lệch nhỏ hơn 0.05) V dịch lọc : 86,73 ml
F : độ pha lỗng mẫu khi tiến hành đo quang
ε : độ hấp thụ của nguyên liệu ở bước sĩng λtương ứng. Với gỗ cao su, ε= 12, λ= 240nm
m: lượng mẫu đem đi phân tích tính theo khối lượng khơ tuyệt đối (mg) Hàm lượng lignin tổng trong nguyên liệu đã trích ly được tính theo cơng thức %L = %AIL + %ASL [91]
2.5.6. Phƣơng pháp xác định lƣợng đƣờng trong mẫu thủy phân bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC- High Performance Liquid Chromatography)
Phân tích sắc ký được thực hiện trên hệ thống HPLC dịng Agilient 1200 (Agilent Technologies, Hoa Kỳ) được trang bị bộ khử khí chân khơng, một máy bơm nhị phân, bộ lấy mẫu tự động, bộ điều khiển nhiệt tĩnh.
Dịch thủy phân và mẫu kiểm chứng của cơ chất được lọc qua màng lọc 0,2µm, sau đĩ được đưa lên cột sắc ký Aminex 87H (300mm x 7,8mm, 9µm) với dung mơi H2SO4 10mM, tốc độ dịng 0,5 mL/phút ở nhiệt độ 60oC. Mẫu đi qua cột được phát hiện bằng chỉ số khúc xạ
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập vi khuẩn từ ruột mối và tuyển chọn chủng cĩ hoạt tính cellulasecao cao
Các mẫu mối được thu thập từ tổ mối trên cây gỗ và mía đã mục, trên thân cây ở các địa điểm khác nhau của các huyện Thanh Chương, Nghi Lộc thuộc địa bàn thành phố Vinh và trường Đại học Bách Khoa Hà nội (Bảng 2.1). So sánh đặc điểm hình thái của mối, đặc điểm của tổ mối với tài liệu định danh cho thấy các mẫu mối thu nhận đều cĩ đặc điểm của lồi mối gỗ khơ Coptotermes.
Ở Việt nam, qua điều tra nhiều năm người ta thấy loại phổ biến nhất thường phá hoại các cơng trình 95-97% (Nguyễn Quốc Huy, 2017) là giống mối
Coptotermes thuộc lồi Rhinotermitidae [92]. Tổ mối trong gỗ thường thấy ở lồi mối khơ, tổ nằm gọn trong thanh gỗ khơng cĩ liên hệ gì với đất, tổ cĩ kết cấu đơn giản, quần thể khơng lớn thường cĩ các lỗ thơng từ hang này đến hang khác hoặc thơng ra ngồi
Hình 3.1.Hình ảnh mẫu mối thu thập
Khả năng phân giải cellulose của chủng được đánh giá thơng qua tỷ lệ đường kính vịng thủy phân với đường kính khuẩn lạc D/d [93][94][95].
Kết quả chi tiết đặc điểm khuẩn lạc và khả năng tạo vịng thủy phân của các chủng phân lập từ ruột mối được trình bày ở phụ lục 1 (Bảng PL1-5). Số lượng chủng phân lập từ các mẫu mối và khả năng tạo vịng thủy phân trên mơi trường nhuơm congo 1% của các chủng phân lập đươc tổng hợp ở bảng 3.1.
Bảng 3.1Thống kê kết quả phân lập vi khuẩn từ ruột mối
Ký hiệu mẫu mối
03 04 05 06 07 08 Tổng
Kết quả bảng 3.1 cho thấy số lượng vi khuẩn phân lập được từ các mẫu tương đối lớn 108 chủng vi khuẩn. Tuy nhiên tỷ lệ các chủng cĩ tỷ lệ đường kính vịng thủy phân/đường kính khuẩn lạc (D/d) cao lại khơng nhiều. Số lượng chủng cĩ D/d ≥ 5 là 11/108 chiếm 10,2%, số lượng chủng cĩ D/d trong khoảng 2-5 là 31 chủng chiếm 28,7%. Cịn lại phần lớn các chủng cĩ tỷ lệ D/d ≤ 2 chiếm tỷ lệ cao nhất 61,1%.
Các chủng vi khuẩn phân lập từ các mơi trường làm giàu cĩ thành phần khác nhau cũng khơng giống nhau. Các mẫu mối 1, 2, 3, 4 được làm giàu cùng lúc trên 5 loại mơi trường M1, M2, M3, M4 và M5 được tổng kết trên bảng 3.2.
Bảng 3.2Số lượng các chủng vi khuẩn phân lập được trên các mơi trường làm giàu
STT Mơitrường làm giàu 1 M1 2 M2 3 M3 4 M4 5 M5 Tổng
Kết quả bảng 3.2, cho thấy các mơi trường làm giàu M1 và M3 là mơi trường khống nghèo dinh dưỡng cho số lượng chủng loại lớn hơn so với các mơi trường cịn lại. Mơi trường M4 và M5 là mơi trường M3 bổ sung thêm glucose và M2 là mơi trường cĩ pepton nhưng lại cho số lượng chủng loại vi khuẩn phân lập được thấp hơn, điều này cĩ thể được giải thích là do mơi trường giàu dinh dưỡng kích thích các loại vi khuẩn sinh trưởng nhanh phát triển làm lấn át các chủng vi khuẩn sinh trưởng chậm hơn dẫn đến mặc dù số lượng khuẩn lạc lớn hơn nhưng số chủng loại lại ít hơn.
Các chủng cĩ khả năng sinh cellulase cao là những chủng cĩ tỷ lệ D/d > 5 [71]. Trong nghiên cứu này để đảm bảo lựa chọn được các chủng cĩ hoạt độ cellulase cao vừa đảm bảo tính đa dạng, các chủng cĩ tỷ lệ D/d từ 4,8 trở lên, cĩ hình thái khuẩn lạc khác nhau từ các mẫu mối, trên mơi trường làm giàu và cơ chất làm giàu khác nhau được lựa chọn và tổng hợp ở bảng 3.3. Cĩ thể thấy chủng cĩ tỷ lệ D/d cao nhất đạt giá trị 10 là chủng G4.
Kết quả bảng 3.3 khi so sánh với nghiên cứu của Pratima Gupta và cộng sự (2011) cho thấy cĩ sự tương đương, trong nghiên cứu của Gupta đã phân lập được 4 chủng vi khuẩn cĩ khả năng phân giải cellulose từ ruột mối trên mơi trường khống, nghèo dinh dưỡng trong thời gian 7 ngày, các chủng phân lập cĩ tỷ lệ đường kính vịng thủy phân/ đường kính khuẩn lạc D/d dao động từ 4,32 đến 5,49 và tỷ lệ D/d lớn nhất là 9 [94]. Trong một nghiên cứu khác của tác giả NYI Merkar Saptarini khi tiến hành phân lập trên mối và nguồn cacbon chủ yếu là lõi ngơ. Kết quả phân lập được 3 chủng cĩ tỷ lệ D/d trong khoảng 5,02 – 5,24 [71]. So với các nghiên cứu đã cơng bố thì kết quả của chúng tơi là khả quan khi cĩ 2 chủng với tỷ lệ D/d trong khoảng từ 8-10.
Bảng 3.3Các chủng cĩ tỷ lệ (D/d) cao được chọn lựa
STT Cơ chất sử dụng cho quá trình làm giàu 1 CMC 2 3 4 5 6 7 8 Giấy lọc 9 Cơ chất tự nhiên
10 cám gạo, đậu tương
11
Các chủng vi khuẩn cĩ tỷ lệ đường kính vịng thủy phân cao tiếp tục được nuơi trên mơi trường lỏng LB với cơ chất CMC và bã mía 0,5%, ở nhiệt độ 370C, lắc 150 vịng/phút. Kết quả xác định hoạt độ enzym tương ứng (Bảng 3.4 và Hình 3.2).
Bảng 3.4Hoạt độ cellulase và xylanase của các chủng vi khuẩn lựa chọn TT Ký hiệu chủng 1 TM1-7.1 2 MP3 3 MP1 4 CG2 5 G4 6 CG4 7 T2-11 8 CM2-4 9 D1-8 10 D1-12 11 CG4-1-2 ND- Khơng xác định
Hình 3.2Hoạt độ enzym các chủng vi khuẩn từ ruột mối
Các chủng lựa chọn cĩ hoạt độ CMCase dao động trong khoảng từ 0,124 U/ml đến 0,752 U/mL. So sánh với hoạt độ của các vi khuẩn phân lập từ ruột mối theo cơng bố của Sharma và cộng sự cho thấy các vi khuẩn phân lập được từ ruột mối ở Nepal thuộc các lồi Bacillus, Cellulomonas và Enterobacter cũng cĩ hoạt độ CMCase từ 0,07 U/ml – 0,2 U/ml [96]. Các vi khuẩn phân lập được từ mối bậc cao theo Sreeremya và cộng sự cũng đã xác định được là các chủng Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis, E.coli và Serratia marscens cĩ hoạt độ từ CMCase 0,05 U/ml -0,9 U/ml [34].
Các chủng phân lập được ngồi hoạt tính CMCase cịn cĩ hoạt tính các hoạt tính khác như FPU, β-glucosidase, acevilase và xylanase. Trong các thí nghiệm này do chưa tối ưu điều kiện sinh tổng hợp enzym nên hoạt độ các enzym cịn tương đối thấp. Chủng cĩ hoạt độ CMCase cao nhất là G4 sau đĩ là MP1 và T2-11 tương ứng với 3 chủng cho tỷ lệ D/d cao nhất (Bảng 3.3). Đặc biệt chủng MP1 cĩ hoạt độ FPU và xylanase cao nhất trong các chủng, hứa hẹn tiềm năng khai thác để thủy phân lignocellulase.
3.2. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh lý, sinh hĩa của các chủng lựa chọn 3.2.1. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh lý, sinh hĩa
Bảng 3.5.Đặc điểm hình thái, sinh lý của 11 chủng vi khuẩn tuyển chọn STT Ký hiệu chủng 1 CM2-4 2 CG2 3 CG4 4 CG4-1- 2 5 D1-8 6 D1-12
T2-11 8 TM1- 7-1 9 G4 10 MP1 11 MP3
Kết quả nhuộm Gram, khả năng tạo bào tử và quan sát hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc cho thấy cĩ 7/11 ( 63,6%) chủng lựa chọn là CM2-4, CG4-1-2, G4, D1-8, D1-12, T2-11, G4 cĩ nhiều đặc điểm giống chi Bacillus như trực khuẩn gram dương, tạo bào tử và sinh catalase. Kết quả này tương đồng với các kết quả đã cơng bố là Bacillus chiếm tỉ lệ cao trong hệ vi sinh vật ruột mối [25][6][9]. Các chủng
Bacillus thường cĩ khả năng sinh tổng hợp cellulase cao và do vậy là điều dễ hiểu khi chiếm tỷ lệ lớn trong các chủng lựa chọn.
Sử dụng 2 loại kit là Kit 20E và Kit 50 CHB để xác định các đặc tính sinh hĩa của các chủng lựa chọn. Kết quả thể hiện ở bảng phụ lục 1 bảng 6 và bảng 7
Sau khi đã cĩ bảng đặc tính của các chủng vi khuẩn chúng tơi tiếp tục phân tích trình tự 16S rDNA để định tên các vi khuẩn đã lựa chọn.
3.2.2. Định tên các vi khuẩn ruột mối
Kết hợp phương pháp định tên bằng 16S RNA và các đăc điểm sinh lý sinh hĩa vi khuẩn, dựa trên tham khảo tài liệu định tên theo Bergey [97]. Chúng tơi đã cĩ kết quả định tên các chủng vi khuẩn như trên bảng 3.8
Bảng 3.6Kết quả định tên các chủng vi khuẩn lựa chọn từ ruột mối
STT Ký hiệu chủng 1 CM2-4 2 CG2 3 CG4 4 CG4-1-2 5 T2-11 6 TM1-7-1 7 G4 8 MP1 9 MP3
Cĩ thể thấy các chủng vi khuẩn phân lập được tương đối đa dạng, hầu hết các lồi phân lập được trong nghiên cứu cũng đã từng được cơng bố trước đây, như cơng bố của Sreeremya và cộng sự cũng đã phân lập được các vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis, E.colivà Serratia marscens từ ruột mối bậc cao ở Ấn Độ [34]. Cơng bố khác của Wenzel và cộng sự cho biết đã áp dụng điều kiện nuơi cấy hiếu khí và phân lập được 119 chủng vi khuẩn cellulolytic từ ruột mối Zootermopsis angusticollis, các chủng này thuộc các nhĩm Cellulomonas,
Microbacterium, Bacillus, Rhizobium, Pseudomonas [9]. Kết quả phân lập vi khuẩn từ ruột mối ở Nepan cũng cho thấy các chủng phân lập được xác định là Bacillus,
Tại Việt Nam theo cơng bố của Nguyễn Thị Thảo và cộng sự cho thấy số lồi vi khuẩn cĩ khả năng sinh cellulase chủ yếu trong ruột mối thuộc ngành Firmicutes (15/24 lồi), phần lớn thuộc lớp Clostridia, bộ Clostridiales. Lồi chiếm ưu thế nhất cĩ khả năng sinh cellulase là Pseudomonas fluorescens thuộc bộ Pseudomonadaceae. Trong 18 lồi sinh hemicellulase, lồi chiếm ưu thế nhất là
Clostridium thermocellum thuộc ngành Firmicutes, sau đĩ 3 lồi thuộc ngành Bacterroidetes. Các vi khuẩn cĩ khả năng sinh cellulase, hemicellulase được ước đốn là C.thermocellum, Ruminococus flavefacien và Bacilus subtilis [39].