Các chủng vi khuẩn được thử khả năng sinh cellulase trên đĩa thạch bằng cách cấy chấm điểm trên mơi trường rắn D5 cĩ chứa 1% CMC, nuơi ở 30°C, trong 48 giờ. Sử dụng thuốc thử congo đỏ 1% trên đĩa thạch, để yên 15 phút sau đĩ đổ sạch thuốc thử congo đi rồi rửa lại bằng dung dich NaCl 1M trong 20 phút, tiếp đĩ đổ hết dung dịch NaCl ra khỏi đĩa thạch và quan sát sự hình thành vịng thủy phân xung quanh khuẩn lạc. Chủng cĩ khả năng sinh cellulase là chủng mà xung quanh khuẩn lạc tạo vịng thủy phân trong suốt [25]. Năng lực thủy phân của chủng phân lập được tính theo Saptarini và Indriyati [71].
Năng lực thủy phân = D / d
d: đường kính khuẩn lạc (mm)
2.4.1.3. Xác định đặc tính sinh lý, hĩa sinh của vi khuẩn sinh cellulase
Phản ứng catalase và khả năng di động được thực hiện theo tài liệu cơng bố [73]. Các đặc tính sinh hĩa của chủng vi khuẩn tuyển chọn được thực hiện sử dụng Kit API
Phản ứng Gram và Hình thái khuẩn lạc được thực hiện theo phương pháp mơ tả [73].
2.4.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của điều kiện nuơi cấy tới khả năng sinh tổng hợp cellulase
Chủng vi khuẩn được nhân giống trong mơi trường nhân giống, sau đĩ tiếp giống vào các mơi trường sinh tổng hợp enzym với tỷ lệ, ở điều kiện nhiệt độ, tốc độ lắc, thời gian như mơ tả trong bài. Dịch sau lên men được đem đi ly tâm loại sinh khối thu dịch nổi. Dịch nổi được dùng để xác định hoạt tính cellulase bao gồm CMCase, FPU, Acevilase.
2.4.2.1. Lựa chọn mơi trường thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase của chủng vi khuẩn tuyển chọn của chủng vi khuẩn tuyển chọn
Chủng vi khuẩn được nuơi ở các mơi trường sinh tổng hợp enzym khác nhau là M3, LB và M6 (Thành phần mơi trường ở mục 2.3.3).
2.4.2.2. Ảnh hưởng của các thơng số kỹ thuật đến sinh tổng hợp enzym
Ảnh hưởng tỉ lệ tiếp giống: thay đổi tỷ lệ tiếp giống 5%, 10% và 15% , xác định hoạt độ enzym thơ các mẫu tương ứng.
Ảnh hưởng của tốc độ lắc: thay đổi tốc độ lắc từ 0 vịng/phút đến 250 vịng/phút, xác định hoạt độ enzym tương ứng
Ảnh hưởng nhiệt độ: thay đổi nhiệt độ lần lượt là 25ºC, 30ºC, 37ºC và 45ºC, xác định hoạt độ enzym thơ các mẫu tương ứng.
Ảnh hưởng pH: điều chỉnh pH thay đổi từ pH 3 đến pH 9, xác định hoạt độ enzym thơ các mẫu tương ứng.
2.4.2.2. Ảnh hưởng của thời gian thu nhận
Vi khuẩn nuơi trên các mơi trường sinh tổng hợp enzym đã lựa chọn. Với điều kiện nhiệt độ, tốc độ lắc, tỷ lệ tiếp giống đã lựa chọn. Lấy mẫu ở các thời điểm khác nhau 24h, 48h,72h và 96h đem xác định hoạt độ cellulase ở các thời điểm tương ứng.
2.4.2.6. Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng trong mơi trường nuơi cấy
Nguồn dinh dưỡng cacbon: thay đổi các nguồn cacbon như Tinh bột, CMC, cám gạo ở các nồng độ khác nhau.
Nguồn dinh dưỡng nitơ: thay đổi các nguơn nitơ khác nhau bao gồm casein, bột đậu tương, NH4NO3, cao nấm men, peptone, NaNO3.
Nồng độ bột đậu tương: thay đổi nồng độ bột đậu tương từ 5g/l đến 20 g/l, xác định hoạt độ enzym thu được tương ứng
2.4.2.7. Phương pháp qui hoạch thực nghiệm tối ưu mơi trường sinh tổng hợp CMCase cho Bacillus subtilis G4 sử dụng phần mềm Design Expert 7.1 hợp CMCase cho Bacillus subtilis G4 sử dụng phần mềm Design Expert 7.1
Trên cơ sở kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của từng yếu tố tới sinh tổng hợp cellulase, tiến hành nghiên cứu tối ưu hĩa điều kiện sinh tổng hợp cellulase với các yếu tố ảnh hưởng lớn nhất đến hoạt tính cellulase đã được khảo sát ở mục 2.4.2.6 là nồng độ tinh bột, casein và bột đậu tương. Phương pháp tối ưu bề mặt đáp ứng với 3 yếu tố ảnh hưởng được thiết kế như Bảng 2.4. Hoạt độ CMCase là biến phụ thuộc (Bảng 2.4). Sử dụng phần mềm Design-Expert 7.1 (State-Ease, Inc, Minneapolis, Mỹ) để phân tích các hệ số hồi quy, thiết lập bề mặt đáp ứng và tối ưu hĩa theo hàm mong đợi, ANOVA được sử dụng để đánh giá các thơng số thống kê.
Bảng 2.2.Giá trị mã hĩa và thực nghiệm Design-Expert 7.1
Mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
15 16 17 18 19 20
2.4.3. Nghiên cứu thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm cellulase thu từ
Bacillus subtilis G4
2.4.3.1. Thu nhân chế phẩm cellulase từ vi khuẩn
Dịch nuơi cấy được ly tâm 6000 vịng/phút trong 10 phút ở 4ºC sau đĩ loại bỏ kết tủa để thu nhận dịch enzym thơ. Thêm tác nhân kết tủa là muối (NH4)2SO4 và acetone ở các nồng độ nhau ở nhiệt độ 2ºC vào dịch enzym thơ để kết tủa protein sau đĩ ly tâm 10000 vịng/phút trong 10 phút ở 4ºC thu kết tủa. Hịa tan lại kết tủa trong dung dịch đệm xitrat với thể tích đệm sử dụng bằng với thể tích enzym thơ ban đầu. Xác định lại hoạt độ CMCase, hàm lượng protein của mẫu sau kết tủa để đánh giá hiệu suất thu hồi enzym và độ tinh sạch của chế phẩm enzym thu nhận.
Hiệu suất thu hồi (%) =
Độ tinh sạch của enzym (lần) =
2.4.3.2. Đặc tính của chế phẩm cellulase thu nhận.
Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt
Nhiệt độ tối ưu của chế phẩm cellulase được xác định thơng qua xác đinh hoạt độ CMCase của chế phẩm được ủ với cơ chất ở các nhiệt độ khác nhau. Cho vào ống nghiệm 0,5 ml enzym thêm 1,0 ml dung dịch cơ chất CMC 1% trong đệm citrate pH 4.8, ủ trong thời gian 30 phút ở các nhiệt độ khác nhau 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C và 80°C [75].
Độ bền của enzym được xác định thơng qua xác định hoạt độ CMCase cịn lại sau thời gian ủ 30 phút ở các nhiệt độ khác nhau. Lấy 1ml enzym vào trong đệm citrate 0,05M (pH 4,8) ủ với các nhiệt độ khác nhau từ 30ºC, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C, 80°C và 90°C trong thời gian 30 phút. Sau đĩ xác định hoạt tính cịn lại của
pH tối ưu của enzym được xác định thơng qua hoạt độ CMCase chế phẩm được ủ với cơ chất ở pH phản ứng khác nhau. Chuẩn bị dung dịch đệm cĩ pH khác nhau từ 3 - 10. Cho vào ống nghiệm 0,5 ml enzym + 0,5 ml dung dịch đệm ở các
pH khác nhau (pH3 - pH10) + 0,5 ml cơ chất CMC 2% (pha trong nước cất) đem ủ ở 50oC trong 30 phút. [75].
Độ bền pH của enzym được xác định thơng qua xác định hoạt độ CMCase cịn lại sau thời gian ủ 30 phút ở các pH khác nhau. Lấy 1ml enzym ủ trong dung dịch đêm cĩ pH thay đổi từ pH 3- pH 11, ủ trong thời gian 30 phút. Xác định hoạt tính cịn lại theo theo phương pháp xác định hoạt độ CMCase được mơ tả ở mục 2.5.1. [75].
2.4.4. Khảo sát khả năng thủy phân rơm sử dụng cellulase thu nhận từ vikhuẩn khuẩn
Cơ chất sử dụng để khảo sát khả năng thủy phân của enzym là các nguyên liệu giàu cellulose (rơm). Nguyên liệu sau khi được xử lý, sấy khơ đem sử dụng để làm cơ chất cho quá trình thủy phân
2.4.4.1. Phương pháp tiền xử lý nguyên liệu giàu cellulose
Rơm được rửa sạch, cắt nhỏ và sấy khơ đến khối lượng khơng đổi, sau đĩ đem nghiền nhỏ trong vịng 10 phút bằng máy nghiền hạt và được sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình tiền xử lý.
Rơm nguyên liệu được tiền xử lý bằng phương pháp kiềm theo Tsai và cộng sự. Trước tiên, cho rơm và dung dịch NaOH 10% với tỷ lệ 1:20 (w/v) gia nhiệt đến 90°C trong 1 giờ, sau đĩ đem lọc và rửa sạch cho đến khi pH trung tính, cuối cùng đem sấy khơ, lưu trữ trong các túi nilong và đem xác định các thành phần hĩa học trước khi sử dụng làm cơ chất của quá trình thủy phân bằng enzym [61].
2.4.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu suất đường hĩalignocellulose của rơm sử dụng cellulase từ Cellulosimicrobium cellulans MP1 lignocellulose của rơm sử dụng cellulase từ Cellulosimicrobium cellulans MP1
Thí nghiệm thủy phân được thực hiện trong bình tam giác 250ml, thể tích làm việc là 100ml. Bổ sung nguyên liệu và enzym với các tỷ lệ, thời gian, nhiệt độ và pH như chỉ ra trong từng thí nghiệm. Mẫu đối chứng được làm tương tự mẫu thí nghiệm với enym đã được bất hoạt bằng cách đun sơi trong 15 phút. Kết thúc phản ứng xác định hàm lượng đường khử tạo thành bằng phương pháp DNS. HIệu suất đường hĩa được tính theo cơng thức:
Hiệu suất đường hĩa (%) =
Hàm lượng đường khử trong cơng thức được tính là hiệu lượng đường khử trong mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng.
Ảnh hưởng của thời gian thủy phân: cơ chất được sử dụng ở nồng độ 1%, nồng độ enzym là 75U/g cơ chất, thủy phân ở nhiệt độ 50°C. Lấy mẫu ở các thời điểm khác nhau từ 12 giờ, 24giờ, 48giờ và 72giờ.
Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất đường hĩa: cơ chất được sử dụng ở nồng độ 1%, nồng độ enzym là 75U/g cơ chất, thời gian đã được lựa chọn. Khảo sát thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau 40°C, 50°C, 60°C. Xác định hàm lượng đường khử và hiệu suất đường hĩa tương ứng. Nhiệt độ cho hiệu suất đường hĩa cao nhất là nhiệt độ được lựa chọn
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: nồng độ cơ chất trong dung dịch (g/ml) lần lượt là 1:100; 2:100; 3:100. Nồng độ enzym là 75U/g cơ chất, thời gian, nhiệt độ đã được lựa chọn ở các thí nghiệm trên, Xác định hàm lượng đường khử và hiệu suất đường hĩa tương ứng với nồng độ cơ chất.
Ảnh hưởng của nồng độ enzym: thay đổi nồng độ enzym lần lượt từ 7.5 U/g đến 75U/g. Các thơng số khác đã được lựa chọn ở trên. Xác định hàm lượng đường khử và hiệu suất đường hĩa tương ứng với nồng độ enzym để lựa chọn nồng độ enzym thích hợp
Ảnh hưởng của pH: thay đổi pH khác nhau từ pH 4,0 đến pH 7,0. Các yếu tố được lựa chọn ở trên, xác định hàm lượng đường khử và hiệu suất thủy phân tương ứng để lựa chọn giá trị pH phù hợp
2.4.5. Phân tích trình tự rRNA, sinh lý, sinh hĩa và 16S
Hình dáng và kích thước của chủng vi khuẩn được xác định bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) JSM-5410 (JEOL, Tokyo, Nhật Bản). Quá trình nhuộm Gram được thực hiện bằng phương pháp thơng thường và xác nhận bằng phép thử
KOH[76].
Bộ gen DNA để giải trình tự 16S rRNA được chuẩn bị bằng phương pháp chiết bằng phenol-chloroform. Khuếch đại trình tự gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn được thực hiện bằng cách sử dụng cặp mồi đặc hiệu 27F/1492R
Với trình tự: 5r- TAACACATGCAAGTCGAACG-3r và 1492R: 5r-GGTGTGACGGGCGGTGTGTA-3r [77]
Chu trình PCR: mẫu PCR được tiến hành trong tổng thể tích 25 µl. Chương trình PCR được thực hiện ở 6 bước (bước 1: 94oC, 2 phút; bước 2: 94oC, 1 phút; bước 3: 54 đến 57oC, 1 phút; bước 4: 72oC, 1 phút; bước 5: 72oC, 6 phút; bước 6: 4ơC, 60 phút; bước 2, 3 và 4 lặp lại 40 chu kỳ). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng QIAquick Gel Extraction kit và giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động
ABIPRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer tại viện cơng nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam. Trình tự 16S rDNA so sánh với các trình tự tương ứng trên GenBank (NCBI) nhờ cơng cụ Blast (www.ncbi.nlm.nih.gov). So sánh độ tương đồng bằng phần mềm Clustal W [78].
Cây phát sinh lồi dựa trên trình tự gen 16S rDNA được xây dựng trên phần mềm MEGA 6 bằng cách sử dụng phương pháp Maximum –likelihood, dựa trên thuật tốn gamma và Kimura 2 với giá trị bootstrap 1000 [79]. Số liệu cho biết tỷ lệ phần trăm của 1000 mẫu bootstrap và Bifidobacterium bifidum DSM 20456 (S83624) và được sử dụng làm nhánh nhĩm ngồi.
Trình tự gen16S rDNA của chủng MP1 được gửi vào ngân hàng gen (NCBI) theo số gia nhập MW534740.
2.4.6. Phƣơng pháp giải trình tự hệ genom của Cellulosimicrobium cellulans MP1 và dự đốn gen chức năng
2.4.6.1. Tách chiết DNA hệ gen của vi khuẩn
Để xây dựng thư viện, DNA được chiết từ khuẩn lạc lấy trên mơi trường nuơi cấy bằng cách sử dụng G-spinTM Total DNA Extraction mini Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Số lượng và chất lượng của DNA được đánh giá bằng điện di trên gel agarose 0,6% (w/v) và máy quang phổ NanoDrop 2000 Thermo Scientific để xây dựng thư viện bộ gen. Thư viện bộ gen đã xây dựng sau đĩ được giải trình tự bằng cách sử dụng thiết bị Illumina (Illumina, California, Hoa Kỳ)
2.4.6.2 Giải trình tự DNA đa hệ gen bằng máy giải trình tự thế hệ mới HiSeq2000của Illumina của Illumina
Giải trình tự DNA hệ gen được chia làm 3 giai đoạn: tạo thư viện NGS (Next Generation Sequencing), tạo nhĩm DNA và giải trình tự DNA bằng phương pháp tổng hợp [80].
- Tạo thư viện NGS: Mẫu DNA đa hệ gen được máy cắt DNA (Covaris S220) cắt ngẫu nhiên thành các đoạn DNA kích thước khoảng 100 bp. Sau đĩ, mỗi đoạn DNA được gắn với adapter (oligonucleotide) chuyên biệt ở cả 2 đầu. Các đoạn DNA cĩ kích thước thích hợp được lựa chọn và được phân lập. Sau bước làm sạch mẫu, thư viện DNA được định lượng bằng qPCR và kiểm tra chất lượng bằng máy phân tích sinh học Bioanalyzer. Cuối cùng, DNA-adapter được biến tính thành sợiđơn.
- Tạo nhĩm DNA: trình tự adapter của các phân tử DNA-adapter sợi đơn sẽ liên kết bổ sung với 2 loại trình tự tương ứng đã được gắn sẵn trên các rãnh bề mặt của 1 vi bản. Sau đĩ, chính trình tự đã được gắn trên bề mặt vi bản sẽ được dùng làm mồi để tổng hợp sợi DNA mới cĩ trình tự bổ sung với sợi DNA liên kết với nĩ tạo thành phân tử DNA sợi đơi. Phân tử DNA sợi đơi này sẽ được biến tính tạo thành 2 sợi đơn, mỗi sợi mới cĩ một đầu gắn trên bề mặt vi bản, đầu cịn lại cũng là trình tự adapter nên nĩ sẽ liên kết với một trình tự khác trên adapter tạo thành cầu DNA sợi đơn. Từ cầu DNA sợi đơn này sẽ dùng 2 đầu adapter làm mồi tổng hợp
thành cầu DNA sợi đơi. Cầu DNA bị biến tính và tạo thành 2 phân tử DNA sợi đơn cĩ một đầu gắn với bề mặt vi bản và đầu cịn lại tự do lại tiếp tục tạo cầu DNA đơn. Quá trình khuếch đại và biến tính lại lặp đi lặp lại cho đến khi tạo thành hàng triệu nhĩm DNA sợi đơn. Trong mỗi nhĩm các sợi DNA cĩ trình tự giống hệt nhau.
- Giải trình tự bằng tổng hợp: các deoxynucleoside triphosphate (dNTP) được sử dụng để giải trình tự đều gắn với nhân tố kết thúc đảo ngược đã được đánh dấu huỳnh quang. Mỗi loại nucleotide được đánh dấu huỳnh quang màu sắc khác nhau. Chu kì giải trình tự bắt đầu khi dNTP thứ nhất được gắn bổ sung với khuơn DNA. dNTP này sẽ được tia lase quét để xác định đỉnh màu sắc huỳnh quang tạo ra, đồng thời dưới tác động của lase, nhân tố kết thúc đảo ngược của dNTP đĩ sẽ bị phân hủy. Lúc này, dNTP thứ hai mới cĩ thể tiếp tục gắn vào nucleotide thứ nhất và lại được xác định. Quá trình giải trình tự cứ lặp đi lặp lại như vậy cho đến khi sợi DNA bổ sung được tổng hợp xong. Trình tự nucleotide được xác định dựa trên các đỉnh màu sắc. Máy HiSeq 2000 giải trình tự đồng thời 10 triệu cụm DNA.
Kiểm sốt chất lượng và cắt bớt chỉ số được thực hiện bằng FastQC phiên bản 0.11.5 (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc) và phiên bản Trimmomatic 0,36 [81].
2.4.6.3. Lắp ráp de novo hệ gen và đánh giá chất lượng lắp ráp
Tập hợp bộ gen de novo được thực hiện bằng SPAdes v.3.13 [82], sau đĩ được phân tích và hồn chỉnh bằng cách sử dụng điểm chuẩn đa phương tiện (BUSCO) phiên bản 3 (https://gitlab.com/ezlab/busco).
Chất lượng lắp ráp được đánh giá dựa trên các thơng số như: kích thước hệ gen, chỉ số N50 (chỉ số N50 là kích thước của các contig đã được sắp xếp theo độ dài từ lớn đến nhỏ tại vị trí kích thước đạt 50% bộ gen) và các trình tự đọc này được