Ngồi các yếu tố vật lý thì việc thay đổi các nguồn dinh dưỡng trong mơi trường nuơi cấy cũng làm ảnh hưởng lớn tới hoạt độ của enzym. Trong nghiên cứu này ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng nito, cacbon và nguồn bột đậu tương, một thành phần cơ bản trong mơi trường M6 đến hoạt độ CMCase sẽ được nghiên cứu. Kết quả thu được trình bày trên Hình 3.6
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon (A), nito (B) và bột đậu
tương lên hoạt độ CMCase của B. subtilis G4
Kết quả Hình 3.6 (A) cho thấy tinh bột là nguồn cacbon tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp cellulase của chủng B. subtilis G4. Hoạt tính CMCase tăng 1,4 lần so với cám gạo với cùng nồng độ 1%. Nếu tiếp tục tăng nồng độ tinh bột từ 1% lên 2% hoạt tính CMCase tiếp tục tăng lên gấp 1,3 lần tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nồng độ tinh bột lên 2,5% hoặc 3% hoạt độ CMCase bị giảm. Đáng chú ý là CMC cho hoạt tính CMCase thấp hơn so với các nguồn cacbon khác. Trong nghiên cứu của Y.Lugani, R.Singla và cộng sự hay của Behera, Mishra (2016) thì CMC lại cho hoạt tính CMCase cao hơn so với các nguồn cacbon khác đối với B. licheniformis
và Bacillus sp Y3 và B. licheniformis CDB12 [110][107].
Kết quả này cho thấy nguồn cacbon là tinh bột cĩ ảnh hưởng rất lớn tới quá trình sinh CMCase của B. subtilis G4. Tác dụng tích cực của tinh bột lên quá trình sinh tổng hợp cellulase của B. subtilis G4 cĩ thể giải thích là do các gen mã hĩa các enzym thủy phân tinh bột và cellulose đều chung một gen điều khiển trong hệ gen vi khuẩn G4.
Kết quả nghiên cứu Hình 3.6 (B) cho thấy Casein là nguồn nitơ tốt nhất và cĩ tác động lớn quá trình sinh cellulase đối với chủng G4. Kết quả này giống với cơng bố của Sing và cộng sự 2014, casein lại nguồn nitơ tốt hơn cao nấm men và các nguồn nitơ khác đối với quá trình sinh cellulase của Bacillus VITRKHB [111]. Tuy nhiên nghiên cứu của Abou-Taleb và cộng sự 2009 lại cho thấy cao nấm men
và peptone là 2 nguồn nitơ tốt nhất cho quá trình sinh cellulase của B. alcalophilus
S39 và B. amyloliquefaciens C2 [112].
Bột đậu tương là một thành phần của mơi trường M6. Bột đậu tương chứa 57.4% protein và 32.2% tinh bột (Akingbala, Oguntimenin et al, 1995).Kết quả trên Hình 3.6 C cho thấy với nồng độ 1.5% bột đậu tương trong mơi trường thu được CMCase cĩ hoạt tính cao nhất.
Dựa trên kết quả các khảo sát về nguồn dinh dưỡng Nitơ, nguồn Cacbon và hàm lượng bột đậu tương trong mơi trường M6 (Hình 3.6) cho thấy tinh bột, casein và bột đậu tương cĩ tác động mạnh tới quá trình sinh CMCase của chủng G4. Mơi trường cho quá trình sinh CMCase được tối ưu hĩa sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt.
Kết quả phân tích hồi qui Bảng 3.7 cho thấy mơ hình cĩ ý nghĩa (p<0.0001), 3 yếu tố Tinh bột, Casein và Bột đậu tương đều cĩ ảnh hưởng lớn đến hoạt độ CMCase (p<0.05).
Giá trị “Lack of Fit”, (sự khơng tương thích của mơ hình) mà chương trình tính tốn và đưa ra p = 0,0787. Điều này cĩ nghĩa, sự khơng phù hợp của mơ hình ở đây là khơng cĩ nghĩa. Khẳng định mơ hình đưa ra cĩ nghĩa.
Hệ số tương quan bội R2 = 0,9233 thể hiện sự lệch giá trị thực so với mơ hình là rất nhỏ chỉ cĩ 7,67%. Trong mơ hình này, giá trị R2 = 0,9233 > 0.75. Cĩ thể kết luận rằng tính tương thích của mơ hình là khá cao.
Hoạt độ CMCase được biểu diễn bằng mơ hình bậc hai như sau:
CMCase = 4,44 + 0,47A + 1,21B + 0,75C + 0,14AB – 0,11AC – 0,32BC – 0,62A2 – 0,24B2 - 0,45C2
Bảng 3.7Phân tích hồi quy (ANOVA) kết quả thí nghiệm
Yếu tố Mơ hình A (Tinh bột) B (Casein) C(Bột tương) AB AC
A2 B2 C2 Residual Lack of Fit Pure Error Cor Total
Hình 3.7Bề mặt đáp ứng của quá trình sinh tổng hợp CMCase từ
Bacillus G4 cho thấy sự tương tác giữa (a) Hàm lượng bột đậu tương và tinh bột . (b) Hàm lượng Casein và Tinh bột. (c) Hàm lượng bột đậu
tương và casein.
Kết quả tối ưu cho thấy hoạt tính CMCase cao nhất đạt được là 5,63 U/ml ở nồng độ casein 19,92g/l, nồng độ bột đậu tương 15,9 g/l và nồng độ tinh bột 19,52 g/l. Tại các giá trị tối ưu hoạt tính enzym tăng lên 1,68 lần so với trước tối ưu. Kết quả xác định hoạt độ FPU của dịch enzym thơ sau tối ưu cĩ hoạt độ đạt được là 0,113 ± 0,005 U/ml. Sự tăng hoạt độ CMCase trên mơi trường sau tối ưu đã được kiểm chứng bằng vịng khuyếch tan đĩa thạch và zymogram (Hình 3.8).
Hình 3.8Zymogram (A) và vịng thủy phân (B) trên mơi trường cám (1) và mơi trường tinh bột (3)
Trên Hình 3.9 là động thái sinh tổng hợp CMCase của B. subtilis G4 trên mơi trường trước tối ưu và sau tối ưu cho thấy sự tăng hoạt độ CMCase rõ rệt trên mơi trường sau tối ưu (Hình 3.9A). Kết quả xác định số lượng vi sinh vật cũng cho thấy sự gia tăng mật độ tế bào lên gần 2 cơ số log là một trng những nguyên nhân dẫn đến sự gia tăng hoạt độ CMCase trên mơi trường sau tối ưu
Hình 3.9.Kết quả xác định hoạt độ CMCase và mật độ tế bào trên
mơi trườngtrước và sau tối ưu