Tập hợp bộ gen de novo được thực hiện bằng SPAdes v.3.13 [82], sau đĩ được phân tích và hồn chỉnh bằng cách sử dụng điểm chuẩn đa phương tiện (BUSCO) phiên bản 3 (https://gitlab.com/ezlab/busco).
Chất lượng lắp ráp được đánh giá dựa trên các thơng số như: kích thước hệ gen, chỉ số N50 (chỉ số N50 là kích thước của các contig đã được sắp xếp theo độ dài từ lớn đến nhỏ tại vị trí kích thước đạt 50% bộ gen) và các trình tự đọc này được đánh giá chất lượng bằng phần mềm FastQC, được xử lý phần mềm Trimmomatic [81], với các thơng số SLIDINGWINDOW:8:20 để loại bỏ các trình tự cĩ chất lượng thấp hơn Q20 và CROP:215 để loại bỏ các base cĩ tín hiệu nhiễu từ sau vị trí 215. Quá trình lắp ráp được thực hiện bằng phần mềm VelvetOptimiser (Gladman và Seemann, 2012) để lắp ráp với giá trị từ k-mer cĩ kích thước bằng 36 bp (giá trị khởi đầu mặc định của phần mềm) đến k-mer cĩ kích thước bằng 211 bp (độ dài lớn nhất của trình tự đọc) và chọn ra bản lắp ráp cĩ tập contig tốt nhất với k-mer = 87. 2.4.6.4. Dự đốn gen và chú giải hệ gen
Những contig của hệ gen được thực hiện dự đốn bằng hai phần mềm là Prodigal (Hyatt và cs., 2010); GeneMarkS (Besemer và cs., 2001). Đối với Prodigal và GeneMarkS các thơng số được mặc định cho đối tượng vi khuẩn. Để chọn ra
những gen để đảm bảo độ tin cậy, những gen cĩ trình tự tương đồng 100% giữa kết quả của cả 2 phần mềm được lọc để sử dụng cho các phân tích tiếp theo.
Các gen sau khi dự đốn được chú giải trên cơ sở dữ liệu NR (non- redundant) bằng phần mềm Blast ++ [83] với e-value = 1e-6. Những kết quả tương đồng trên cơ sở dữ liệu NR tiếp tục được chú giải trên cơ sở dữ liệu GO (Gene Ontology) (Ashburner và cs., 2000) và KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (Kanehisa và Goto, 2000) bằng phần mềm Blast2GO (Conesa và cs.,2005) với các thơng số mặc định. AntiSMASH (antibiotics and secondary metabolite analysis shell) là phần mềm chạy từ web server tìm các cụm gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp enzym bằng thuật tốn profile hidden Markov model (pHMM) (Weber và cs., 2015). AntiSMASH sẽ dự đốn bằng Prodigal với vi khuẩn đã tích hợp sẵn. NaPDos là cơng cụ phát hiện và phân tích nhanh các gen chuyển hĩa thứ cấp. Cơng cụ này được thiết kế và phát hiện domain C và KS từ dữ liệu DNA hoặc axit amin. Các domain chuyển hĩa thứ cấp được xác định bằng so sánh trình tự với tập hợp các gen tham chiếu từ các con đường hĩa học. Trình tự gen được tiên đốn sản phẩm tạo thành và xác định những sản phẩm này cĩ thể tạo ra những chất tương tự hay các con đường sinh tổng hợp đã biết.
Bản đồ đồ họa của hệ gen trịn được tạo bằng PATRIC (Wattam và cộng sự) [84]. Trình tự hệ gen dự thảo được gửi vào cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) theo số gia nhập: JAFGYF000000000
Phân tích sự giống nhau của tồn bộ hệ gen
Để phân loại chủng MP1 đến cấp độ lồi, sự tương đồng của tồn bộ hệ gen được tính tốn nhận dạng nucleotide trung bình (ANI) và lai DNA-DNA kỹ thuất sơ (dDDH) đã được thực hiện.ANI được tính tốn bằng cách sử dụng nhận dạng nucleotide trung bình trực giao (OrthoANI) [85]. Dữ liệu trình tự bộ gen MP1 đã được tải lên máy chủ để phân tích phân loại (http://tygs.dsmz.de).
Hệ gen so sánh và dự đốn hoạt tính Carbohydrate giũa chủng MP1 và 3 lồi
C.cellulans khác cĩ trong GenBank, bao gồm J36 (NZ_JAGJ01000000.1).
2.5. Các phƣơng pháp phân tich 2.5.1. Xác định hoạt độ các enzyme
Hoạt độ endoglucanase (CMCase)
Hoạt độ endoglucanase được xác định theo phương pháp của Ghose[86]. Lấy 0.5 ml dịch enzym với 1ml cơ chất CMC 1% trong đệm Xitrat 50mM ( pH = 4,8), ủ hỗn hợp ở 50 C trong 30 phút. Lượng đường khử tạo thành được xác định bằng phương pháp DNS ở bước sĩng 540 nm với chất chuẩn là glucose.
Một đơn vị hoạt tính enzym (U/ml) được định nghĩa là lượng enzym cần tiết để thủy phân cơ chất CMC thành 1µmol glucose trong thời gian 1 phút trên thể tích 1ml
Hoạt tính CMCase ( Trong đĩ :
µmol/phút/ml) = [87]
D : Hàm lượng đường khử dựa vào giá trị OD của đường chuẩn 103 : Hệ số chuyển đổi
180: Phân tử lượng Glucose 30 : Thời gian phản ứng f : Hệ số pha lỗng
1,5: Tổng thể tích phản ứng
0,5: Thể tích enzym tham gia phản ứng
Hoạt độ FPU
Hoạt độ Filter paper unit FPU được xác định theo phương pháp của Ghose. Lấy 0,5 ml dịch enzym với 1ml dung dich đệm Xitrat 50mM ( pH = 4,8), cơ chất là giấy lọc kích thước 1,0 x 6,0 cm trong đệm, ủ hỗn hợp ở 50 C trong 60 phút. Lượng đường khử tạo thành được xác định bằng phương pháp DNS ở bước sĩng 540nm với chất chuẩn là glucose.
Một đơn vị hoạt tính FPU (U/ml) được định nghĩa là lượng enzym cần tiết để thủy phân cơ chất giấy lọc thành 1µmol glucose trong thời gian 1 phút trên thể tích 1ml
Hoạt tính FPU ( Trong đĩ :
µmol/phút/ml) =
D : Hàm lượng đường khử dựa vào giá trị OD của đường chuẩn 103 : Hệ số chuyển đổi
180: Phân tử lượng Glucose 60 : Thời gian phản ứng f : Hệ số pha lỗng
1,5: Tổng thể tích phản ứng
0,5: Thể tích enzym tham gia phản ứng .
Hoạt độ exoglucanase (acevilase)
Hoạt độ Acevilase được xác định theo phương pháp của Ghose. Lấy 0,5 ml dịch enzym với 1,5 ml dung dich đệm citrate 50mM ( pH = 4,8), cơ chất là Avicel 1% trong đệm, ủ hỗn hợp ở 50 C trong 60 phút. Lượng đường khử tạo thành được xác định bằng phương pháp DNS ở bước sĩng 540nm với chất chuẩn là glucose.
Một đơn vị hoạt độ exoglucanase là lượng enzym cần thiết để thủy phân Avicel tạo thành 1 μmol glucose trong 1 phút. Lượng đường khử sinh ra được phân tích bằng phương pháp DNS [88]
Hoạt độ exoglucanase được tính theo cơng thức:
Hoạt độ Avicelase = (U/ml)
Trong đĩ:
2: Tổng thể tích phản ứng (ml) f: Hệ số pha lỗng enzym C: Nồng độ đường khử (mg/ml) 1000: Hệ số quy đổi mmol ra µmol 180: khối lượng phân tử glucose 60: Thời gian phản ứng enzym (phút) 0,5: thể tích enzym phản ứng (ml)
Hoạt độ β-glucosidase
Phân tích được tiến hành theo phương pháp của Parry et al. (2001) theo trình tự như sau (cĩ thay đổi cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm): 0,5 ml đệm citrate 0,05M pH 4.8 trộn với 0,5 ml p-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside (10mM), thêm vào, giữa phản ứng ở 0,5 ml enzym 50oC/ 30 phút. Bổ sung 3 ml đệm NaOH- glycine 0,4M pH 10,8 và đo ở OD405nm
Một đơn vị hoạt độ β-glucosidase là lượng enzym cần thiết để giải phĩng 1 μmol p-nitrophenol trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm. Hoạt độ enzym đo bằng cách đo độ phát quang của cơ chất được giải phĩng ở bước sĩng 405nm
Hoạt độ β-glucosidase được tính theo cơng thức:
Hoạt độ β-glucosidase = (U/ml)
Trong đĩ:
1,5: Tổng thể tích phản ứng (ml) f: Hệ số pha lỗng enzym
C: Nồng độ p-nitrophenol (mg/ml) 1000: Hệ số quy đổi mmol ra µmol 139: khối lượng phân tử p-nitrophenol 30: Thời gian phản ứng enzym (phút) 0,5: thể tích enzym tham gia phản ứng (ml)
Phân tích được tiến hành theo phương pháp của Ghose và cộng sự [64] cĩ thay đổi cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm, cụ thể như sau: 0,4 ml xylan 1% trộn với 0,4 ml enzym và ủ 50oC, 30 phút. Lượng đường khử sinh ra được phân tích bằng phương pháp DNS.
Một đơn vị hoạt độ xylanase được định nghĩa là lượng enzym cần thiết thủy phân xylanase 1% (pha trong đệm 0,05M citrate pH4,8) để giải phĩng 1µmol xylose trong 1 phút ở pH 4,8, nhiệt độ 50oC.
Hoạt độ xylanase được tính theo cơng thức:
Hoạt độ xylanase = (U/ml)
Trong đĩ:
0,8: Tổng thể tích phản ứng f: Hệ số pha lỗng enzym C: nồng độ đường khử (mg/ml) 1000: Hệ số quy đổi mmol ra µmol 150: khối lượng phân tử xylose
30: Thời gian phản ứng enzym (phút) 0,4: thể tích enzyme phản ứng (ml)
2.5.2. Xác định hàm lƣợng protein
Lượng protein trong mẫu enzym được xác định theo phương pháp Lowry [89] tại bước sĩng 756 nm sử dụng chất chuẩn là Albumin huyết thanh bị.
Lượng protein trong mẫu được tính theo cơng thức Hàm lượng protein (g/g hoặc g/ml) =
a: là hàm lượng protein tương ứng xác định được từ đường chuẩn n: là hệ số pha lỗng mẫu
m: khối lượng hoặc thể tích mẫu đưa vào
2.5.3. Xác định độ ẩm nguyên liệu
Cân chính xác 5g rơm cho vào cốc sạch, khơ đã biết khối lượng trước. Đưa mẫu vào tủ sấy và sấy ở 105ºC đến khối lượng khơng đổi. Sau khi sấy lấy mẫu ra cho vào bình hút ẩm để làm nguội, cân. Tiếp tục sấy đến khối lượng khơng đổi. Khi kết quả giữa 2 lần cân cuối cùng cĩ sai số ± 0,5 là coi như khối lượng khơng đổi.
X(%) =
Trong đĩ: m1: Khối lượng mẫu trước khi sấy m2: Khối lượng mẫu sau khi sấy
m: Khối lượng mẫu trước khi sấy
2.5.4. Xác định hàm lƣợng cellulose
Mẫu được nghiền nhỏ thích hợp, sau đĩ xử lý lần lượt bằng dung dịch axit sulfuric và dung dịch natrihydroxit đun sơi. Cặn được tách bằng cách lọc, rửa, sấy khơ, cân sau đĩ tro hĩa. Sự hao hụt khối lượng sau khi tro hĩa được gọi là cellulose [90]
Cân 2 - 3g mẫu cho vào bình hình cầu dung tích 1 lit, thêm vào 200ml dung dịch H2SO4 1,5%, lắp sinh hàn sau đĩ gia nhiệt đến sơi trong khoảng 30 phút. Lọc dung dịch qua giấy lọc và rửa lại nhiều lần bằng nước cất đun sơi cho đến khi khơng cịn axit, dùng giấy pH để thử. Tiếp tục dùng 200ml dung dịch NaOH nồng độ khoảng 2-5% và gia nhiệt đến sơi trong vịng 30 phút để tiếp tục thủy phân. Thêm 2- 3 giọt chất chống tạo bọt và tiến hành quá trình như xử lý. Lọc dung dịch sau đĩ rửa bã nhiều lần bằng nước cất và HCl 1% đến khi hết kiềm, dùng giấy pH để thử.
Chuyển tồn bộ xơ bã vào một chén nung đã sấy khơ, cân bì. Sấy chén cĩ xơ bã trong tủ sấy ở nhiệt độ 1050C trong 1 giờ, để nguội, cân. Sấy lại cho đến khối lượng khơng đổi.
Chuyển chén nung vào lị nung, nung đến tro trắng, làm nguội trong bình hút ẩm, cân. Nung đến khối lượng khơng đổi.
Hàm lượng cellulose thơ cịn được tính bằng % theo khối lượng chất khơ như sau:
X(%) =
Trong đĩ:
Mo – Khối lượng của mẫu, tính bằng g;
M1 - khối lượng chất xơ và cặn sau khi sấy, tính bằng g;
M2 – Khối lượng chất xơ và cặn sau khi đốt nĩng trong lị nung, tính bằng g Wo - Hàm lượng chất khơ của mẫu, biểu thị theo %
Kết quả là trung bình cộng của kết quả 2 lần xác định song song, tính chính xác đến 0,01%.
Cân 0,3g mẫu vào ống nghiệm, ghi lại khối lượng mẫu (chính xác đến 0,1mg). Thêm 3ml NaOH 2M, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ nhàng sau đĩ để luơn đũa trong ống. Ủ 30°C, 60±5 phút. Mỗi 5-10 phút lại khuấy 1 lần, chú ý khơng nhấc đũa ra khỏi ống nghiệm.
Chuẩn bị các mẫu đối chứng đường (glucose, xylose, galacyose, arabinose, mannose) cĩ nồng độ gần nhất với nồng độ ước tính cĩ trong mẫu phân tích để hiệu chỉnh lượng đường bị phân hủy trong quá trình thủy phân bằng kiềm. Pha 10ml dung dịch đường với nồng độ yêu cầu, thêm 348µl NaOH 2M. Chuyển sang các ống nghiệm thủy tinh và đậy kín. Hấp 121°C, 1h các mẫu đường đối chứng và mẫu phân tích sau đĩ để nguội tự nhiên.
Xác định hàm lượng lignin khơng tan trong kiềm(AIL)
Nung chén ở 575±25°C đến khối lượng khơng đổi (sai lệch khối lượng khơng vượt quá 0.3mg sau 60 phút nung), ghi lại khối lượng chén.
Sấy giấy lọc khơng tro ở 105°C đến khối lượng khơng đổi, ghi lại khối lượng mo. Lọc dịch thủy phân thu được ở bước giấy lọc khơng tro với hệ thống hút chân khơng. Thu khoảng 50ml dịch lọc vào falcon để xác định hàm lượng lignin khơng tan trong acid và carbonhydrate. Mẫu dịch cĩ thể bảo quản tối đa 2 tuần trong vịng 6h kể từ khi kết thúc quá trình thủy phân.
Dùng 50ml nước deion để rửa phần bã cịn lại trên giấy lọc. Dùng nước nĩng cĩ thể giúp quá trình lọc diễn ra nhanh hơn.
Sấy phần rắn đến khối lượng khơng đổi, ít nhất 4h ở 105°C. (khối lượng sau sấy là m1=khối lượng giấy lọc + khối lượng lignin khơng tan trong kiềm + khối lượng tro khơng tan trong kiềm). Chuyển tồn bộ giấy lọc khơng tro và bã sau sấy vào chén nung đã biết trước khối lượng. Nung ở 600°C ± trong 24h ± 6h đến khối lượng khơng đổi (khối lượng sau nung là m2 = khối lượng chén nung + khối lượng tro khơng tan trong kiềm).
Lượng tro khơng tan trong kiềm: mAIR = m2 - m chén nung (g)
Lượng lignin khơng tan trong kiềm: mail =m1 - mgiấy lọc - mAIR (g)
Hàm lượng lignin khơng tan trong kiềm của nguyên liệu đã trích ly: %AIL=100×mAIL / mo
Với:
Mo (g) là khối lượng khơ tuyệt đối của nguyên liệu đem đi phân tích M1 (g) là tổng khối lượng sau khi sấy ở 105°C
Phân tích hàm lượng lignin tan trong kiềm(ASL)
Sử dụng máy đo UV-VIS, set blank bằng nước deion hoặc NaOH
Đo mẫu dịch lọc thu được ở bước sĩng thích hợp, chú ý pha lỗng bằng chính dung dịch set blank sao cho giá trị độ hấp thụ nằm trong khoảng 0.7 đến 1.0
Hàm lượng lignin tan trong kiềm của nguyên liệu đã trích ly: %ASL = (100×OD×V dịch lọc×F) / ( ε ×λ× m )
Trong đĩ :
OD: giá trị độ hấp phụ trung bình của ít nhất 2 lần đo (sai lệch nhỏ hơn 0.05) V dịch lọc : 86,73 ml
F : độ pha lỗng mẫu khi tiến hành đo quang
ε : độ hấp thụ của nguyên liệu ở bước sĩng λtương ứng. Với gỗ cao su, ε= 12, λ= 240nm
m: lượng mẫu đem đi phân tích tính theo khối lượng khơ tuyệt đối (mg) Hàm lượng lignin tổng trong nguyên liệu đã trích ly được tính theo cơng thức %L = %AIL + %ASL [91]
2.5.6. Phƣơng pháp xác định lƣợng đƣờng trong mẫu thủy phân bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC- High Performance Liquid Chromatography)
Phân tích sắc ký được thực hiện trên hệ thống HPLC dịng Agilient 1200 (Agilent Technologies, Hoa Kỳ) được trang bị bộ khử khí chân khơng, một máy bơm nhị phân, bộ lấy mẫu tự động, bộ điều khiển nhiệt tĩnh.
Dịch thủy phân và mẫu kiểm chứng của cơ chất được lọc qua màng lọc 0,2µm, sau đĩ được đưa lên cột sắc ký Aminex 87H (300mm x 7,8mm, 9µm) với dung mơi H2SO4 10mM, tốc độ dịng 0,5 mL/phút ở nhiệt độ 60oC. Mẫu đi qua cột được phát hiện bằng chỉ số khúc xạ
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập vi khuẩn từ ruột mối và tuyển chọn chủng cĩ hoạt tính cellulasecao cao
Các mẫu mối được thu thập từ tổ mối trên cây gỗ và mía đã mục, trên thân cây ở các địa điểm khác nhau của các huyện Thanh Chương, Nghi Lộc thuộc địa bàn thành phố Vinh và trường Đại học Bách Khoa Hà nội (Bảng 2.1). So sánh đặc điểm hình thái của mối, đặc điểm của tổ mối với tài liệu định danh cho thấy các mẫu mối thu nhận đều cĩ đặc điểm của lồi mối gỗ khơ Coptotermes.
Ở Việt nam, qua điều tra nhiều năm người ta thấy loại phổ biến nhất thường phá hoại các cơng trình 95-97% (Nguyễn Quốc Huy, 2017) là giống mối
Coptotermes thuộc lồi Rhinotermitidae [92]. Tổ mối trong gỗ thường thấy ở lồi mối khơ, tổ nằm gọn trong thanh gỗ khơng cĩ liên hệ gì với đất, tổ cĩ kết cấu đơn giản, quần thể khơng lớn thường cĩ các lỗ thơng từ hang này đến hang khác hoặc thơng ra ngồi
Hình 3.1.Hình ảnh mẫu mối thu thập
Khả năng phân giải cellulose của chủng được đánh giá thơng qua tỷ lệ đường kính vịng thủy phân với đường kính khuẩn lạc D/d [93][94][95].
Kết quả chi tiết đặc điểm khuẩn lạc và khả năng tạo vịng thủy phân của các chủng phân lập từ ruột mối được trình bày ở phụ lục 1 (Bảng PL1-5). Số lượng chủng phân lập từ các mẫu mối và khả năng tạo vịng thủy phân trên mơi trường nhuơm congo 1% của các chủng phân lập đươc tổng hợp ở bảng 3.1.
Bảng 3.1Thống kê kết quả phân lập vi khuẩn từ ruột mối
Ký hiệu mẫu mối
03 04 05 06 07 08 Tổng
Kết quả bảng 3.1 cho thấy số lượng vi khuẩn phân lập được từ các mẫu tương đối lớn 108 chủng vi khuẩn. Tuy nhiên tỷ lệ các chủng cĩ tỷ lệ đường kính