từ vi khuẩn MP1
Nhiệt độ là một yếu tố rất quan trong trong quá trình sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong các bài báo, nghiên cứu trước đây, các chủng thuộc chi Cellulosimicrobium được xác định là những chủng ưa ấm với khả năng sinh sống trong khoảng nhiệt độ từ 20-40oC [114].
Với pH mơi trường các chủng thuộc chi Cellulosimicrobium cĩ thể sống, sinh trưởng và tổng hợp enzym trong một khoảng pH khá rộng (từ 6.0 đến 10.5) nhưng thường sinh các enzym cellulase, xylanase tốt hơn ở mơi trường kiềm yếu từ 7,5 đến 9. Vì vậy, khoảng pH được lựa chọn là từ 7 đến 11, nhiệt độ được chọn trong khoảng 25ºC đến 45ºC cho quá trình nghiên cứu
Hình 3.15Ảnh hưởng các thơng số kỹ thuật tới sinh tổng hợp enzym từ MP1
Kết quả nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase của vi khuẩn MP1 cho thấy, vi khuẩn MP1 sinh CMCase tốt nhất trên mơi trường M6 ở 37ºC, pH 7,5, tỷ lệ giống 5% và tốc độ lắc 100 vịng/phút, các điều kiện này cũng giống với điều kiện sinh enzym của chủng vi khuẩn
Cellulosimicrobium cellulans được phân lập từ mẫu tảo đỏ [115]. Với kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sinh tổng hợp enzym cho thấy MP1 sinh CMCase tốt nhất ở 37 oC. Kết quả thu được cĩ sự tương đồng với kết quả được cơng bố bởi Naami và cs, khi Cellulosimicrobium sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 29oC nhưng lại sinh enzym amylase tốt nhất ở 35oC [116]. Một số nghiên cứu khác cũng đã sử dụng nhiệt độ 37oC để nuơi cấy các chủng Cellulosimicrobium phục vụ mục đích thu một số loại enzym xylanase và mannanase [102][12].
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH của mơi trường nuơi cấy cho thấy pH trong khoảng 7,0-10 là pH phù hợp cho quá trình sinh enzym đối với chủng MP1. Kết quả này cho thấy rằng chủng Cellulosimicrobium sp.MP1 là một chủng chịu kiềm, khi pH mơi trường ban đầu tăng trong khoảng từ pH 7 đến pH 10 thì hoạt độ CMCase giảm khơng đáng kể. Kết quả này cũng giống với cơng bố của Liu và cộng sự khi nghiên cứu chủng C.cellulans L804 phân lập từ đất sinh trưởng tốt nhất ở pH 7,0 và chỉ giảm mạnh ở pH 10,5 [12].
Thời gian là một trong các yếu tố quan trọng cho quá trình sinh enzym của vi khuẩn. Nghiên cứu yếu tố thời gian để xác định được thời điểm thu nhận enzym từ vi khuẩn. H oạ t đ ộ CM Ca se (U /m l) 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 24h 48h 72h 96h
Thời gian nuơi cấy (giờ)
Hình 3.16Ảnh hưởng của thời gian nuơi cấy đến hoạt độ CMCase của
Cellulosimicrobium sp MP1
Cũng tương tự như chủng vi khuẩn Bacillus G4 chủng MP1 cũng cĩ thời gian thích hợp nhất cho quá trình thu nhận enzym là 72 giờ.
3.4.2. Ảnh hƣởng các nguồn dinh dƣỡng tới quá trình sinh tổng hợp CMCase
3.4.2.1. Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng nitơ
Thay thế nguồn nitơ bởi cao nấm men, casein và NaNO3 bởi nguồn nitơ vơ cơ NH4Cl, NH4NO3. Kết quả xác định hoạt độ được thể hiện trên Bảng 3.12, hoạt độ của các mơi trường chứa nguồn nitơ khác nhau được xác định khi nuơi cấy chủng Cellulosimicrobium sp. MP1. Kết quả thu được như bảng sau
Bảng 3.12Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng N tới khả năng sinh enzym
Nguồn Nitơ Peptone 1% Casein 1% Casein 0,5% NH4NO3 1% Cao nấm men 1% Khơng cĩ nitơ
Kết quả Bảng 3.12 cho thấy chủng Cellulosimicrobium sp. MP1 cho hoạt độ CMCase cao nhất khi sử dụng casein. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Liu và cộng sự khi nuơi cấy C.cellulans L804 cho trên các nguồn N khác nhau. Cao
nấm men cho chủng phát triển tốt trong khi NaNO3 làm cho chủng phát triển chậm và hoạt chất sinh học thu được thấp.
3.4.2.2. Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon
Các nguồn cacbon khác nhau được sử dụng lần lượt trong mơi trường M6. Kết quả xác định hoạt độ enzym trên các mơi trường cĩ nguồn cacbon tương ứng thu được số liệu như bảng sau:
Bảng 3.13Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng cacbon tới khả năng sinh enzym
Nguồn Cacbon Glucose1% Cám gạo 1% Cám gạo 2% Tinh bột 1% Tinh bột 2% Tinh bột 2,5%
Kết quả trên cho thấy tinh bột 1% là nguồn cacbon tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp cellulase của chủng vi khuẩn MP1. Như vậy, cũng giống với chủng G4, với nguồn cacbon tinh bột hoạt tính CMCase tăng cao nhất so với các nguồn cacbon khác.
3.4.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng bột đậu tương tới quá trình sinh cellusae
Ảnh hưởng của bột đậu tương đã được khảo sát với kết quả thu được như sau:
Bảng 3.14Ảnh hưởng của nồng độ bột đậu tương tới khả năng sinh enzym của
chủng Nồngđộ bột tƣơng (%) 0 0,5 1,0 1,5 2.0
Kết quả trên cho thấy với nồng độ 1.5% bột đậu tương trong mơi trường thu được CMCase cĩ hoạt tính cao nhất.
Quá trình nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện lên men và ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng trong mơi trường nuơi cấy đã tìm được điều kiện phù hợp cho quá trình sinh cellulase từ chủng vi khuẩn MP1.
Vi khuẩn MP1 được nuơi trên mơi trường cĩ nồng độ tinh bột 1%, casein 1%, bột đậu tương 1,5 % với các điều kiện nhiệt độ 37ºC, thời gian nuơi cấy 72h, tỷ lệ giống 5%, tốc độ lắc 100 vịng/phút, pH mơi trường 7,5 là mơi trường phù hợp cho quá trình sinh cellulase. Hoạt độ CMCase đạt cao nhất là 3,25 U/ml. Đây là mơi trường được lựa chọn để thu nhận enzym cho các nghiên cứu khảo sát khả năng thủy phân của enzym từ MP1.
3.4.2. Xác định đặc tính cellulase tạo thành bởi Cellulosimicrobium sp. MP1
3.4.2.1. Thu nhận chế phẩm cellulase bằng kết tủa bởi ethanol
Dịch enzym thơ thu sau ly tâm được kết tủa sử dụng cồn tuyệt đối với các nồng độ cuối khác nhau 20%, 40%, 60% và 80%.
Bảng 3.15Thơng số enzym từ MP1 sau kết tủa bằng ethanol
Nồng độ V dich dung (mL) mơi E thơ 100 20% 10 40% 10 60% 10 80% 10
Kết quả Bảng 3.15 cho thấy khi nồng độ ethanol càng cao, lượng protein kết tủa thu được càng nhiều và đạt cao nhất ở nồng độ cồn 80% với hiệu suất thu hồi theo protein đạt 31,43%. Tuy hiệu suất thu hồi enzym đạt cao nhất tại nồng độ cồn 80% nhưng độ tinh sạch chỉ đạt 4,00%. Độ tinh sạch enzym cao nhất tại 60% cồn đạt 5,56. Do đĩ, chế phẩm enzym ở nồng độ cồn 60% v/v được lựa chọn cho nghiên cứu đặc tính chế phẩm.
3.4.2.2. Xác định đặc tính chế phẩm cellulase thu từ Cellulosimicrobium sp. MP1 Nhiệt độ và pH tối ƣu
Protein enzym sau khi kết tủa tại nồng độ cồn 60% v/v được hịa tan trong các dung dịch đệm cĩ pH khác nhau.
Hình 3.17.Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của enzyme CMCase từ MP1
Kết quả cho thấy khoảng pH hoạt động hiệu quả của enzym kết tủa từ dịch lên men của chủng Cellulosimicrobium sp. MP1 là tương đối rộng từ 5-10. Trong đĩ ở pH 6 hoạt độ CMCase đo được là lớn nhất, đạt 0,23 ± 0,003 U/ml. Kết quả này phù hợp với một số báo cáo kết luận pH hoạt động tối ưu của cellulase từ
Cellulosimicrobium là 5-6 [117][118].
So với nghiên cứu tách cellulases kiềm tính từ Bacillus subtilis của Deepmoni Deka (trong đĩ, hoạt độ CMCase đạt tối ưu ở pH 9, nhưng hoạt tính chỉ đạt 70% ở các pH 8 và 10), enzym cellulase từ Cellulosimicrobium sp. MP1 cĩ khoảng pH hoạt động tối ưu rộng hơn, tại pH 10 hoạt độ vẫn đạt gần 90% so với pH tối ưu. Đây là một đặc điểm đáng chú ý cĩ tiềm năng ứng dụng của enzym CMCase thu từ chủng Cellulosimicrobium sp. MP1.
Protein enzym sau khi kết tủa được hịa tan trong đệm Na-phosphate pH 6,0 pha lỗng thích hợp và thực hiện phản ứng với cơ chất CMC (hịa tan trong đệm tương ứng) ở các nhiệt độ khác nhau.
Hình 3.18.Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính CMCase từ MP1
Kết quả cho thấy hoạt độ CMCase cao nhất ở 600C, cao hơn nhiệt độ 500C trong cơng bố của Jian-Min Song và cơng sự khi nghiên cứu cellulases từ
C.cellulans [118]. Ở nhiệt độ 700C, hoạt độ enzym CMCase giảm 20% so với hoạt độ xác định ở nhiệt độ tối ưu.
Xác định độ bền nhiệt và bền pH
Kết quả Hình 3.19 cho thấy ở pH axit bằng 4, hoạt tính enzym giảm mạnh cịn 20% sau 20h. Tuy nhiên, từ khoảng pH 5, độ bền hoạt độ enzyme duy trì tương đối ổn định từ 70-80%.
Hình 3.19.Độ bền pH của chế phẩm cellulase từ MP1
Trong nghiên cứu của Jian-Min Song và cộng sự, hoạt tính CMCase thu từ
C.cellulans giảm mạnh cịn 18% sau 6 giờ ở pH axit 3 và 4. Kết luận này tương đối phù hợp với kết quả thí nghiệm thể hiện trong Hình 3.19. Tuy nhiên, ở các giá trị pH khác, hoạt tính cellulase của chủng MP1 duy trì ổn định tốt hơn so với nghiên cứu của Jian-Min Song. Cụ thể, hoạt tính tương đối của CMCase từ C. cellulans cịn lại lần lượt là 34,39% và 26,26% sau 6giờ ở pH 5 và pH 7, trong khi enzym CMCase từ MP1 duy trì hoạt tính đến 70% sau 20 giờ ở khoảng pH khá rộng từ 5-10.
Kết quả Hình 3.20 cho thấy ở nhiệt độ càng cao, sự suy giảm hoạt tính diễn ra càng nhanh và càng sớm ngay ở những giờ đầu tiên. Sau 2 giờ, hoạt tính CMCase ở nhiệt độ 40°C và 50°C giảm khơng đáng kể cịn hơn 90%. Hoạt tính CMCase tương đối cịn 70% ở nhiệt độ 60°C và giảm mạnh cịn 30% ở nhiệt độ 70°C sau 2 giờ. Khi kéo dài đến 4giờ, hoạt độ của enzym ủ ở các nhiệt độ 40, 50, 60°C giảm cịn 40-43% trong khi hoạt độ chỉ cịn 10% ở 70°C. Trong nghiên cứu về độ bền nhiệt của cellulases thu từ C.cellulans của Jian-Min Song và cộng sự, ở nhiệt độ 45°C, cellulase cịn giữ được 55,68% hoạt tính sau 6h cịn ở nhiệt độ 600C hoạt độ enzym giảm mạnh đến 75-90% . Đối với chủng MP1, hoạt độ CMCase cũng giảm tương tự đến 60% sau 4h ở 600C.
Hình 3.20.Độ bền nhiệt chế phẩm cellulase từ MP1
3.5. So sánh giữa B. subtilis G4 và Cellulosimicrobium sp. MP1
Bảng 3.16.So sánh giữa enzyme từ B. subtilis G4 và Cellulosimicrobium sp. MP1
Thơng số Enzym thơ Hoạt độ CMCase tối ưu Hoạt độ FPU Hoạt độ xylanase Chê phẩm cellulase pH tối ưu Bền pH
Nhiệt độ tối ưu (°C) Bền nhiệt (°C)
Mặc dù enzym thơ từ B. subtilis G4 cĩ hoạt độ CMCase cao hơn từ
điều đĩ dẫn tới hiệu suất thủy phân thấp khi sử dụng enzym từ G4 để thủy phân rơm và bã mía (Hình 3.14). Hơn nữa khi quan sát quá trình thủy phân giấy lọc cĩ thể thấy enzym từ MP1 thủy phân giấy lọc tốt hơn enzym từ G4 (Hình 3.21).
Hình 3.21. Thử nghiệm phân giải giấy lọc của MP1 và G4
Chế phẩm cellulase thu được từ Cellulosimicrobium sp. MP1 cĩ khoảng pH hoạt động rộng hơn và cĩ khả năng hoạt động tốt ở pH kiềm, rất phù hợp để thủy phân nguyên liệu cellulose.
Thử nghiệm với các cơ chất cho thấy chủng MP1 thuộc chi
Cellulosimicrobium phân lập được cĩ khả năng phân hủy các cơ chất bã mía, rơm, giấy lọc (hình 3.21), cho thấy chủng MP1 phân lập được cĩ khả năng tiết ra hỗn hợp các enzym phá hủy được cấu trúc phức tạp của cơ chất. Hỗn hợp này (enzymatic bulk) cĩ thể bao gồm endoglucanases, cellobiohydrolases và β-glucosidases để thủy phân thành tế bào của nguyên liệu, cũng như cĩ chứa endoxylanases và β- xylosidases đĩng vai trị thủy phân các thành phần hemicellulose.
Vi những lý do trên chủng Cellulosimicrobium sp. MP1 sẽ được tiếp tục nghiên cứu ở mức độ AND.
3.5. Xác định đặc tính di truyền và các gen mã hĩa enzym thủy phân cellulosecủa chủng C. cellulans MP1 của chủng C. cellulans MP1
3.5.1. Trình tự gen và một số đặc điểm khái quát của chủng C. cellulans MP1
Vì phân tích trình tự gen đã và đang giúp mở ra con đường tìm hiểu nhiều hơn về các enzym liên quan đến sự phân giải sinh khối thực vật, trình tự gen của chủng C. cellulans MP1 đã được phân tích với kỹ thuật Illumina Miseq. Thư viện gen thu được đã cho ra tất cả là 443 986 169 nucleotit và được tổng hợp để tạo thành 4 487 842 bản đọc với vị trí cụ thể và với độ lặp là 92,2 lần. Trình tự gen của chủng MP1 (4 580 223 bp với hàm lượng GC 73.9%) được sắp xếp lại thành một nhiễm sắc thể hình trịn với 23 contig và khơng phát hiện thấy cĩ plasmid (hình 3.22). Tồn bộ hệ gen của chủng được dự đốn cĩ 4117 gen bao gồm 4 046 trình tự
mã hĩa protein (CDS), 67 trình tự quy định rRNA, 3 trình tự quy định tRNA, 1 trình tự quy định tmRNA (hình 3.22).
Hình 3.22Sơ đồ genom của C.cellulans MP1
3.5.2. Các cụm gen và chức năng gen của chủng MP1
Trong tồn bộ các trình tự mã hĩa protein thì 79.5% (3216 trong 4046) được phân vào 21 trong 25 nhĩm chức năng COG. Trong đĩ, các nhĩm chiếm nhiều nhất là: phiên mã (K: 365 trình tự), vận chuyển và chuyển hĩa carbonhydrate (G: 307), vận chuyển và chuyển hĩa amino acid (E: 224), sản sinh và chuyển hĩa năng lượng (C: 199), và vận chuyển và chuyển hĩa (P: 180). Ngược lại, nhĩm liên quan đến việc điều hịa chu trình, phân chia tế bào và nhiễm sắc thể (D: 33), cấu tạo và điều khiên sợi nhiễm sắc (B: 2) và di chuyển tế bào (N: 1) là các nhĩm chiếm ít nhất.
Việc phân tích chức năng của các gen cung cấp cái nhìn sâu hơn về các chức năng của chủng MP1. Tổng số 3165 gen được phân vào 43 lớp con bao gồm 13 lớp con thuộc lớp cấu tạo tế bào (CC), 10 lớp con thuộc lớp liên quan đến phân tử chức năng (MF), và 20 lớp con liên quan đến các quá trình sinh học (BP). Cụ thể, lớp CC chiếm nhiều gen nhất (1638 gen, 45,3%) tiếp theo là lớp BP (1424 gen, 39,4%) và MF ( 553 gen, 15,3%). Các con đường chiếm nhiều nhất là tế bào (GO:0005623; 508 gen), thành phần tế bào (GO:0044464; 379 gen) và cấu tạo thành tế bào (GO:0016020; 340gen). Trong lớp BP 3 nhĩm chiếm ưu thế là quá trình chuyển hĩa (GO:0008152; 378 gen), quá trình trong tế bào (GO:0009987; 379) gen và phát triển (GO:0040007; 281 gen). Trong các lớp nhỏ thuộc vào lớp MF, các gen thuộc nhĩm cĩ hoạt tính xúc tác (GO:0003824) và bám (GO:0005488) chiếm 311 và 176 gen.
Hình 3.23Phân loại chức năng gen
3.5.3. So sánh COG tồn bộ hệ gen và các enzym liên quan đến chuyển hĩa carbonhydrate
Sự tiến hĩa của vi khuẩn là nhờ sự tiến hĩa thẳng và bắt nguồn từ 1 gen tổ tiên duy nhất, từ đĩ tạo thành các gen tiến hĩa thẳng trong các lồi khác nhau, để cĩ thể hiệu rõ hơn về chức năng, cấu tạo cũng như sự biến đổi của các gen thì cần phải cĩ sự so sánh các nhĩm COG ở các chủng khác nhau. Các nhĩm COG của chủng
C. cellulans MP1 được so sánh với của 4 chủng khác gồm J36, LMG16121, và JKA48. Chủng C. cellulans MP1 cĩ 3405 gen thuộc vào các nhĩm COG và 794 gen độc lập. Các chủng J36 và ZKA48 cĩ lần lượt 3604 và 3605 gen thuộc các nhĩm COG, trong khi chủng LMG16121 cĩ ít gen COG nhất (hình 3.25). Trong đĩ thì số gen đơn lẻ lớn nhất thuộc về chủng MP1. Biểu đồ Venn Edward 6 chiều cho thấy rằng cĩ 2539 gen COG được tìm thấy trong cả 4 chủng thuộc chi C. cellulans. Trong số các COG riêng biệt của mỗi chủng thì chủng MP1 cĩ 20 và là số lượng lớn nhất trong 4 chủng. Để kiểm chứng kết quả này, cơng cụ xây dựng cây phân lồi REALPHY đã được sử dụng. Với lựa chọn cây cĩ khả năng xảy ra cao nhất (maximum likelihood), cây phân lồi được xây dựng cho thấy 2 chủng MP1 và LMG16121 tạo thành một nhánh riêng, cho thấy một mối quan hệ tiến hĩa mật thiết (hình 3.24).
Hình 3.24. Cây phân lồi chủng C.cellulans MP1
Sử dụng trang web dbCAN2, các gen được dự đốn tổng hợp các CAZy của chủng C. cellulans MP1 được sàng lọc để tìm ra các gen liên quan đến việc phân hủy cellulose và hemicellulose. Sau khi loại bỏ các trình tự khơng liên quan, 195 vùng gen được dự đốn là CAZy được tìm thấy, chúng chiếm 4,8% trong tổng số 3216 vùng của chủng này. Các enzym glycoside hydrolase (GH) phụ trách việc phân hủy phần lớn sinh khối thực vật (cellulose và hemicellulose) được dự đốn là họ enzym nhiều nhất và chiếm đến 99 enzym. Tiếp theo là 39 enzym glycosyl transferase (GT), 37 đơn vị bám vào carbohydrate (CBM), 11 enzym carbohydrate esterase (CE), 6 enzym với các hoạt tính phụ trợ (AA) và 3 enzym polysaccharide