Dịch enzym thơ thu sau ly tâm được kết tủa sử dụng cồn tuyệt đối với các nồng độ cuối khác nhau 20%, 40%, 60% và 80%.
Bảng 3.15Thơng số enzym từ MP1 sau kết tủa bằng ethanol
Nồng độ V dich dung (mL) mơi E thơ 100 20% 10 40% 10 60% 10 80% 10
Kết quả Bảng 3.15 cho thấy khi nồng độ ethanol càng cao, lượng protein kết tủa thu được càng nhiều và đạt cao nhất ở nồng độ cồn 80% với hiệu suất thu hồi theo protein đạt 31,43%. Tuy hiệu suất thu hồi enzym đạt cao nhất tại nồng độ cồn 80% nhưng độ tinh sạch chỉ đạt 4,00%. Độ tinh sạch enzym cao nhất tại 60% cồn đạt 5,56. Do đĩ, chế phẩm enzym ở nồng độ cồn 60% v/v được lựa chọn cho nghiên cứu đặc tính chế phẩm.
3.4.2.2. Xác định đặc tính chế phẩm cellulase thu từ Cellulosimicrobium sp. MP1 Nhiệt độ và pH tối ƣu
Protein enzym sau khi kết tủa tại nồng độ cồn 60% v/v được hịa tan trong các dung dịch đệm cĩ pH khác nhau.
Hình 3.17.Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của enzyme CMCase từ MP1
Kết quả cho thấy khoảng pH hoạt động hiệu quả của enzym kết tủa từ dịch lên men của chủng Cellulosimicrobium sp. MP1 là tương đối rộng từ 5-10. Trong đĩ ở pH 6 hoạt độ CMCase đo được là lớn nhất, đạt 0,23 ± 0,003 U/ml. Kết quả này phù hợp với một số báo cáo kết luận pH hoạt động tối ưu của cellulase từ
Cellulosimicrobium là 5-6 [117][118].
So với nghiên cứu tách cellulases kiềm tính từ Bacillus subtilis của Deepmoni Deka (trong đĩ, hoạt độ CMCase đạt tối ưu ở pH 9, nhưng hoạt tính chỉ đạt 70% ở các pH 8 và 10), enzym cellulase từ Cellulosimicrobium sp. MP1 cĩ khoảng pH hoạt động tối ưu rộng hơn, tại pH 10 hoạt độ vẫn đạt gần 90% so với pH tối ưu. Đây là một đặc điểm đáng chú ý cĩ tiềm năng ứng dụng của enzym CMCase thu từ chủng Cellulosimicrobium sp. MP1.
Protein enzym sau khi kết tủa được hịa tan trong đệm Na-phosphate pH 6,0 pha lỗng thích hợp và thực hiện phản ứng với cơ chất CMC (hịa tan trong đệm tương ứng) ở các nhiệt độ khác nhau.
Hình 3.18.Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính CMCase từ MP1
Kết quả cho thấy hoạt độ CMCase cao nhất ở 600C, cao hơn nhiệt độ 500C trong cơng bố của Jian-Min Song và cơng sự khi nghiên cứu cellulases từ
C.cellulans [118]. Ở nhiệt độ 700C, hoạt độ enzym CMCase giảm 20% so với hoạt độ xác định ở nhiệt độ tối ưu.
Xác định độ bền nhiệt và bền pH
Kết quả Hình 3.19 cho thấy ở pH axit bằng 4, hoạt tính enzym giảm mạnh cịn 20% sau 20h. Tuy nhiên, từ khoảng pH 5, độ bền hoạt độ enzyme duy trì tương đối ổn định từ 70-80%.
Hình 3.19.Độ bền pH của chế phẩm cellulase từ MP1
Trong nghiên cứu của Jian-Min Song và cộng sự, hoạt tính CMCase thu từ
C.cellulans giảm mạnh cịn 18% sau 6 giờ ở pH axit 3 và 4. Kết luận này tương đối phù hợp với kết quả thí nghiệm thể hiện trong Hình 3.19. Tuy nhiên, ở các giá trị pH khác, hoạt tính cellulase của chủng MP1 duy trì ổn định tốt hơn so với nghiên cứu của Jian-Min Song. Cụ thể, hoạt tính tương đối của CMCase từ C. cellulans cịn lại lần lượt là 34,39% và 26,26% sau 6giờ ở pH 5 và pH 7, trong khi enzym CMCase từ MP1 duy trì hoạt tính đến 70% sau 20 giờ ở khoảng pH khá rộng từ 5-10.
Kết quả Hình 3.20 cho thấy ở nhiệt độ càng cao, sự suy giảm hoạt tính diễn ra càng nhanh và càng sớm ngay ở những giờ đầu tiên. Sau 2 giờ, hoạt tính CMCase ở nhiệt độ 40°C và 50°C giảm khơng đáng kể cịn hơn 90%. Hoạt tính CMCase tương đối cịn 70% ở nhiệt độ 60°C và giảm mạnh cịn 30% ở nhiệt độ 70°C sau 2 giờ. Khi kéo dài đến 4giờ, hoạt độ của enzym ủ ở các nhiệt độ 40, 50, 60°C giảm cịn 40-43% trong khi hoạt độ chỉ cịn 10% ở 70°C. Trong nghiên cứu về độ bền nhiệt của cellulases thu từ C.cellulans của Jian-Min Song và cộng sự, ở nhiệt độ 45°C, cellulase cịn giữ được 55,68% hoạt tính sau 6h cịn ở nhiệt độ 600C hoạt độ enzym giảm mạnh đến 75-90% . Đối với chủng MP1, hoạt độ CMCase cũng giảm tương tự đến 60% sau 4h ở 600C.
Hình 3.20.Độ bền nhiệt chế phẩm cellulase từ MP1