3.3.1. Nghiên cứu lựa chọn mơi trƣờng và điều kiện thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase
3.3.1.1. Lựa chọn mơi trường sinh tổng hợp cellulase
Bacillus subtilis G4 được nuơi cấy trên các mơi trường LB, M1 M2 và M6 trong thời gian 48 giờ ở 37°C, tốc độ lắc 100 vịng/phút, sau đĩ xác đinh hoạt tính CMCase trên các mơi trường tương ứng, kết quả thu được như trên Hình 3.3
H oạ t đ ộ CM Ca se (U /m l) 2 1.5 1 0.5 0 LB M1 M2 M6
Mơi trường sinh tổng hợp
Hình 3.3Hoạt độ CMCase của chủng B. subtlis G4 trên các mơi trường nuơi cấy
Kết quả hình 3.3 cho thấy, với các mơi trường nuơi cấy khác nhau thì khả năng sinh CMCase của G4 cũng khác nhau, trong đĩ M6 là mơi trường thích hợp
nhất cho quá trình sinh CMCase. M6 là mơi trường cĩ các thành phần cám gạo, bột đậu tương và casein, đây là mơi trường mà các thành phần cĩ nguồn gốc tự nhiên, cĩ thể thấy chủng G4 phát triển tốt hơn so với các mơi trường mà các thành phần là hĩa chất tinh khiết. Mơi trường M6 cũng là mơi trường được Li và cộng sự đã sử dụng nuơi cấy để thu nhận endo-cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis YJ1[75].
Chúng tơi lựa chọn M6 làm mơi trường sinh tổng hợp cellulase cho các nghiên cứu tiếp theo. Trên mơi trường M6 chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối đã được cơng bố bởi Sreena và cộng sự. cĩ hoạt tính từ 0,4 U/mg – 1,2 U/mg trên mơi trường chưa tối ưu hĩa [5].
3.3.1.2 Ảnh hưởng của các thơng số lên men đến hoạt độ CMCase
Để thu nhận được enzym cĩ hoạt độ cao trên mơi trường M6, các yếu tố như nhiệt độ, tốc độ lắc, thời gian lên men và pH mơi trường đã được nghiên cứu. Kết quả thu được như hình 3.4
Hình 3.4.Ảnh hưởng của các thơng số nuơi cấy đến hoạt độ
CMCase của B. subtilis G4. Tỷ lệ giống (A), tốc độ lắc (B), Nhiệt độ (C) và pH mơi trường (D).
Từ các kết quả trên cho thấy các yếu tố tỷ lệ cấp giống, tốc độ lắc, nhiệt độ mơi trường và pH mơi trường cĩ ảnh hưởng rất lớn tới hoạt độ enzym, bằng phương pháp nghiên cứu đơn yếu tố kết quả cho thấy hoạt độ enzym thu được đạt cao nhất khi tỷ lệ cấp giống 1%, tốc độ lắc 150 vịng/phút, nhiệt độ mơi trường nuơi cấy 37ºC, pH mơi trương 7.
pH = 7,0 cũng là pH phù hợp nhất cho quá trình sinh enzym của Bacillus sp S3B8 phân lập từ ruột mối [104]. Tuy nhiên, cơng bố của Sreeremya và cộng sự cũng cho biết, các chủng Bacillus phân lập từ ruột mối hoạt độ cellulase lớn nhất ở 40ºC, pH từ 9 -10 [34]
Quá trình sinh tổng hợp enzym tồn tại khoảng thời gian cĩ hoạt độ enzym cao nhất, qua thời điểm này hoạt tính enzym sẽ giảm do các yếu tố sinh lý tác động. Vì vậy thời gian thu nhận enzym là yếu tố quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp enzym.
Chủng vi khuẩn G4 được nuơi trong các điều kiện lựa chọn ở trên, thay đổi thời gian khác nhau để xác định thời điểm cĩ hoạt độ CMCase cao nhất. Kết quả thu được như Hình 3.5 H oạ t đ ộ CM Ca se (U /m l) 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 24h48h 72h 96h
Thời gian nuơi cấy (giờ)
Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian nuơi cấy đến sinh tổng hợp CMCase từ vi khuẩn G4 Kết quả xác định hoạt độ ở các thời điểm khác nhau cho thấy với thời gian nuơi cấy là 72 giờ là thời gian thích hợp nhất cho quá trình sinh enzym từ vi khuẩn G4. Với các vi khuẩn thuộc lồi Bacillus từ ruột mối và một số các nguồn phân lập khác đã được nghiên cứu đều cĩ thời gian thích hợp nhất cho quá trình sinh enzym là từ 60 giờ đến 72 giờ [34][105][106].
Hoạt độ enzym thu được từ vi khuẩn G4 cũng tương đương với hoạt độ của các vi khuẩn phân lập từ ruột mối trên mơi trường nuơi cấy sau khi được nghiên cứu các thơng số ảnh hưởng theo cơng bố của Screena và cộng sự, hoạt độ các vi khuẩn dao động từ 2,52-6,01 U/mg [25]. Tuy nhiên, hoạt độ cellulase từ vi khuẩn G4 cao hơn rất nhiều so với các vi khuẩn Bacillus subtillis phân lập từ các nguồn khác như các cơng bố của Reka và cộng sự đã phân lập được các chủng Bacillus subtilis từ đất ngập mặn cao nhất đạt 0,62 UI/ml [107], cơng bố khác của Ariffin và cộng sự cũng đã phân lập chủng Bacillus pumilus EB3 từ vỏ cây cọ với hoạt tính CMCase cao nhất đạt được 0,079U/ml [108]. Chủng Bacillus subtilis phân lập từ rừng nguyên sinh ở Ấn Độ cũng cĩ hoạt tính CMCase cao nhất 0,48 U/ml (cơng bố của Ramalingam và cộng sự, 2014) [109].
3.3.1.3. Ảnh hưởng các nguồn dinh dưỡng đến quá trình sinh tổng hợp cellulase
Ngồi các yếu tố vật lý thì việc thay đổi các nguồn dinh dưỡng trong mơi trường nuơi cấy cũng làm ảnh hưởng lớn tới hoạt độ của enzym. Trong nghiên cứu này ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng nito, cacbon và nguồn bột đậu tương, một thành phần cơ bản trong mơi trường M6 đến hoạt độ CMCase sẽ được nghiên cứu. Kết quả thu được trình bày trên Hình 3.6
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon (A), nito (B) và bột đậu
tương lên hoạt độ CMCase của B. subtilis G4
Kết quả Hình 3.6 (A) cho thấy tinh bột là nguồn cacbon tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp cellulase của chủng B. subtilis G4. Hoạt tính CMCase tăng 1,4 lần so với cám gạo với cùng nồng độ 1%. Nếu tiếp tục tăng nồng độ tinh bột từ 1% lên 2% hoạt tính CMCase tiếp tục tăng lên gấp 1,3 lần tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nồng độ tinh bột lên 2,5% hoặc 3% hoạt độ CMCase bị giảm. Đáng chú ý là CMC cho hoạt tính CMCase thấp hơn so với các nguồn cacbon khác. Trong nghiên cứu của Y.Lugani, R.Singla và cộng sự hay của Behera, Mishra (2016) thì CMC lại cho hoạt tính CMCase cao hơn so với các nguồn cacbon khác đối với B. licheniformis
và Bacillus sp Y3 và B. licheniformis CDB12 [110][107].
Kết quả này cho thấy nguồn cacbon là tinh bột cĩ ảnh hưởng rất lớn tới quá trình sinh CMCase của B. subtilis G4. Tác dụng tích cực của tinh bột lên quá trình sinh tổng hợp cellulase của B. subtilis G4 cĩ thể giải thích là do các gen mã hĩa các enzym thủy phân tinh bột và cellulose đều chung một gen điều khiển trong hệ gen vi khuẩn G4.
Kết quả nghiên cứu Hình 3.6 (B) cho thấy Casein là nguồn nitơ tốt nhất và cĩ tác động lớn quá trình sinh cellulase đối với chủng G4. Kết quả này giống với cơng bố của Sing và cộng sự 2014, casein lại nguồn nitơ tốt hơn cao nấm men và các nguồn nitơ khác đối với quá trình sinh cellulase của Bacillus VITRKHB [111]. Tuy nhiên nghiên cứu của Abou-Taleb và cộng sự 2009 lại cho thấy cao nấm men
và peptone là 2 nguồn nitơ tốt nhất cho quá trình sinh cellulase của B. alcalophilus
S39 và B. amyloliquefaciens C2 [112].
Bột đậu tương là một thành phần của mơi trường M6. Bột đậu tương chứa 57.4% protein và 32.2% tinh bột (Akingbala, Oguntimenin et al, 1995).Kết quả trên Hình 3.6 C cho thấy với nồng độ 1.5% bột đậu tương trong mơi trường thu được CMCase cĩ hoạt tính cao nhất.
Dựa trên kết quả các khảo sát về nguồn dinh dưỡng Nitơ, nguồn Cacbon và hàm lượng bột đậu tương trong mơi trường M6 (Hình 3.6) cho thấy tinh bột, casein và bột đậu tương cĩ tác động mạnh tới quá trình sinh CMCase của chủng G4. Mơi trường cho quá trình sinh CMCase được tối ưu hĩa sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt.
Kết quả phân tích hồi qui Bảng 3.7 cho thấy mơ hình cĩ ý nghĩa (p<0.0001), 3 yếu tố Tinh bột, Casein và Bột đậu tương đều cĩ ảnh hưởng lớn đến hoạt độ CMCase (p<0.05).
Giá trị “Lack of Fit”, (sự khơng tương thích của mơ hình) mà chương trình tính tốn và đưa ra p = 0,0787. Điều này cĩ nghĩa, sự khơng phù hợp của mơ hình ở đây là khơng cĩ nghĩa. Khẳng định mơ hình đưa ra cĩ nghĩa.
Hệ số tương quan bội R2 = 0,9233 thể hiện sự lệch giá trị thực so với mơ hình là rất nhỏ chỉ cĩ 7,67%. Trong mơ hình này, giá trị R2 = 0,9233 > 0.75. Cĩ thể kết luận rằng tính tương thích của mơ hình là khá cao.
Hoạt độ CMCase được biểu diễn bằng mơ hình bậc hai như sau:
CMCase = 4,44 + 0,47A + 1,21B + 0,75C + 0,14AB – 0,11AC – 0,32BC – 0,62A2 – 0,24B2 - 0,45C2
Bảng 3.7Phân tích hồi quy (ANOVA) kết quả thí nghiệm
Yếu tố Mơ hình A (Tinh bột) B (Casein) C(Bột tương) AB AC
A2 B2 C2 Residual Lack of Fit Pure Error Cor Total
Hình 3.7Bề mặt đáp ứng của quá trình sinh tổng hợp CMCase từ
Bacillus G4 cho thấy sự tương tác giữa (a) Hàm lượng bột đậu tương và tinh bột . (b) Hàm lượng Casein và Tinh bột. (c) Hàm lượng bột đậu
tương và casein.
Kết quả tối ưu cho thấy hoạt tính CMCase cao nhất đạt được là 5,63 U/ml ở nồng độ casein 19,92g/l, nồng độ bột đậu tương 15,9 g/l và nồng độ tinh bột 19,52 g/l. Tại các giá trị tối ưu hoạt tính enzym tăng lên 1,68 lần so với trước tối ưu. Kết quả xác định hoạt độ FPU của dịch enzym thơ sau tối ưu cĩ hoạt độ đạt được là 0,113 ± 0,005 U/ml. Sự tăng hoạt độ CMCase trên mơi trường sau tối ưu đã được kiểm chứng bằng vịng khuyếch tan đĩa thạch và zymogram (Hình 3.8).
Hình 3.8Zymogram (A) và vịng thủy phân (B) trên mơi trường cám (1) và mơi trường tinh bột (3)
Trên Hình 3.9 là động thái sinh tổng hợp CMCase của B. subtilis G4 trên mơi trường trước tối ưu và sau tối ưu cho thấy sự tăng hoạt độ CMCase rõ rệt trên mơi trường sau tối ưu (Hình 3.9A). Kết quả xác định số lượng vi sinh vật cũng cho thấy sự gia tăng mật độ tế bào lên gần 2 cơ số log là một trng những nguyên nhân dẫn đến sự gia tăng hoạt độ CMCase trên mơi trường sau tối ưu
Hình 3.9.Kết quả xác định hoạt độ CMCase và mật độ tế bào trên
mơi trườngtrước và sau tối ưu
3.3.3. Thu nhận cellulase kỹ thuật từ B. subtilis G4 và xác định đặc tính của chếphẩm phẩm
3.3.3.1. Thu nhận chế phẩm cellulase kỹ thuật từ B. subtilis G4
Thu dịch enzym bằng ly tâm dịch nuơi cấy 6000 vịng/phút trong 10 phút ở 4ºC. Kết tủa enzym bằng ammonium sulfate nồng độ 60% -80% bão hịa (Bảng 3.8) và acetone 60% -80% (Bảng 3.9).
Bảng 3.8Kết tủa cellulase bằng ammonium sulfate bão hịa
Ammonium
sulfate bão
50 60 70 80
Enzyme thơ
Cả amoni sunfat và aceton đều kết tủa enzym đạt hiệu suất thu hồi cao nhất ở nồng độ dung mơi 80%. Aceton là dung mơi được lựa chọn để kết tủa enzym thơ thu nhận từ Bacillus G4 do cĩ hiệu suất thu hồi cao hơn. Trong nghiên cứu này khi sử dụng aceton làm tác nhân kết tủa cellulase đạt hiệu suất thu hồi 83,57% và độ tinh sạch cao gấp 4,38 lần so với enzym thơ trong khi đĩ với tác nhân là ammonium sunfate 80% thì hiệu suất thu hồi chỉ đạt 59,9%.
Bảng 3.9Kết tủa cellulase bằng acetone
Acetone (%) 50 60 70 80 Enzyme thơ
Kết quả này cũng tương tự với các nghiên cứu trước đây của Ekundayo và cộng sự (2012) khi hiệu suất thu hồi cao nhất tại aceton 80% [74].
Enzym sau khi kết tủa bằng aceton 80% được sử dụng để nghiên cứu một số đặc tính của CMCase như nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu, tính bền nhiệt, bền pH.
3.3.3.2. Đặc tính của chế phẩm cellulase từ vi khuẩn B. subtilis G4
Nhiệt độ tối ưu của enzym là nhiệt độ mà tại đĩ hoạt độ enzym đạt được cao nhất. Tiến hành xác định hoạt độ ở các nhiệt độ từ 30°C đến 90°C, kết quả thể hiện ở Hình 3.10.
Hình 3.10Nhiệt độ tối ưu của CMCase thu nhận từ G4
Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ enzym cho thấy cellulase thu nhận từ G4 cĩ hoạt độ cao nhất ở 60oC. Hoạt độ CMCase ở 70 oC chỉ giảm khoảng 10% tuy nhiên ở 80 oC giảm mạnh và mất hồn tồn hoạt tính ở 90 oC. Nhiệt độ tối ưu của một số chủng Bacillus khác như CH4 và RH trong nghiên cứu của Mawada và cộng sư (2000) là 65°C và 70°C [113].
Nghiên cứu độ bền của enzym bởi nhiệt độ chúng tơi ủ enzym ở các nhiệt độ khác nhau trong 2 giờ. Kết quả xác định hoạt độ cịn lại của enzym so với ban đầu như hình 3.11. CM Ca se c ịn lạ i Ho ạt đ ộ 150 100 50 0 30 40 50 60 70 80 Nhiệt độ (°C)
Hình 3.11Độ bền của enzym bởi nhiệt độ
Kết quả hình trên cho thấy cellulase từ vi khuẩn G4 cĩ hoạt tính ổn định khi bảo quản dưới 50ºC, với nhiệt độ 60ºC trở lên hoạt tính enzym giảm dần và giảm nhanh đến mất hoạt tính khi giữ ở nhiệt độ 70ºC trở lên, kết quả này cũng tương tự khi nghiên cứu độ bền bởi nhiệt độ của cellulase từ các Bacillus [99]. Tuy nhiên khi so sánh với một số chủng Bacillus cĩ khả năng chịu nhiệt thì độ bền nhiệt của G4 kém hơn. Như các chủng Bacillus trong nghiên cứu của Ekundayo và cộng sự thì các chủng này cĩ khả năng chịu được nhiệt độ đến 70ºC [74].
Xác định giá trị pH tối ưu của enzym thu nhận từ vi khuẩn G4 chúng tơi tiến hành xác định hoạt độ enzym ở các pH khác nhau tương ứng pH - 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và pH 10 (sử dụng các dung dịch đệm tương ứng). Để kiểm tra độ bền của enzym bởi pH chúng tơi cho enzym vào các dung dịch đệm cĩ giá trị pH khác nhau và ủ
trong 2 giờ, sau đĩ xác định hoạt tính cịn lại của enzym kết quả thu được ở Hình 3.12 và hình 3.13
Hình 3.12.pH tối ưu cho hoạt dộ CMCase của chế phẩm cellulase từ B. subtilis G4
H oạ t đ ộ CM Ca se c ịn lạ i (% ) 20 0 3 4 5 6 7 8 9 10 pH
Hình 3.13.Độ bền pH của chế phẩm cellulase từ Bacillus G4
Các kết quả trên cho thấy cellulase thu nhận từ G4 cĩ hoạt tính cao nhất tại pH 7, tuy nhiên khoảng pH hoạt động tương đối rộng từ pH 4 tới pH 8, hoạt độ tại 4 và 8 đạt hơn 80% giá trị tối ưu.Hoạt độ giảm nhiều nhất tại pH 3 chỉ bằng 37% trong khi tại pH 9 vẫn đạt tới 67% giá trị tối ưu tại pH7.
Về độ bền của CMCase bởi pH cho thấy enzym bền với các trị pH từ 5-7 với các giá trị pH nhỏ hơn 5 hoạt tính enzym giảm nhanh, với các giá trị pH 8, 9 hoạt tính giảm chậm hơn. So sánh với một số nghiên cứu về giá trị pH hoạt động của các
Bacillus khác cũng cho kết quả tương tự [107][74]. Như vậy chế phẩm cellulase từ B. subtilis G4 hoạt động tốt ở vùng pH từ 5-8.
3.3.4. Khảo sát khả năng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn G4 đối với các vật liệu giàu cellulose. các vật liệu giàu cellulose.
Khảo sát khả năng thủy phân lignocellulose của cellulase từ vi khuẩn G4 chúng tơi sử dụng dịch enzym thơ để thủy phân các cơ chất bã mía, rơm,và các cơ chất đã tiền xử lý bằng NaOH.
Điều kiện thủy phân là các điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzym: Nhiệt độ 60ºC, pH 7,0, nồng độ cơ chất 1% ml, nồng độ enzym 4,5U/ml. Xác định hàm lượng đường khử tạo thành sau 24 giờ thủy phân. Kết quả thu được ở Bảng 3.10
Bảng 3.10Kết quả thủy phân lignocelluloses sử dụng enzym từ vi khuẩn G4
Cơ chất thủy phân
Rơm Bã mía Rơm đã tiền xử lý bằng NaOH Bã mĩa đã tiền xử lý bằng NaOH
Kết quả bảng trên cho thấy hàm lượng đường khử tạo thành sau thủy phân khơng cao dù sử dụng nồng độ enzym lớn trong dung dịch thủy phân (446U/g) hiệu quả quá trình thủy phân thấp, hiệu suất ước tính chỉ đạt từ 15%-30%.
Để biết được thành phần của dịch sau thủy phân chúng tơi tiếp tục phân tích hàm lượng glucose, xylose của dịch sau thủy phân, kết quả xác định thể hiện ở hình 3.14
Hình 3.14:Kết quả phân tích sản phẩm thủy phân bằng HPLC
Kết quả kiểm tra sản phẩm thủy phân bằng HPLC cho thấy khơng cĩ sự tạo thành các sản phẩm đường của quá trình thủy phân như glucose, xylose điều này