Trích ly hai pha nước (ATPE) là một phương pháp trích ly hiệu quả và tiết kiệm cùng với rất nhiều ưu điểm khác, được sử dụng rộng rãi trong phân tách, tinh chế các phân tử sinh học như protein, chiết xuất enzyme, kháng thể, …. (Tanuja & cộng sự, 1997). Một sự ngẫu nhiên khi ATPE được phát hiện bởi Martinus Williem Beijerinck vào năm 1896 khi ông trộn dung dịch nước tinh bột và gelatin, nhưng ứng dụng thực tế của chúng lại được Per-Ake Albertsson tìm ra vào năm 1956, và ATPE được ứng dụng một loạt cho các mục đích sau này (Grilo & cộng sự, 2016; Albertsson, 1958).
1.5.2. Hệ thống trích ly 2 pha nước
Hệ thống trích ly hai pha nước (ATPS) được hình thành khi trộn chung nhiều thành phần trong nước (Hatti-Kaul, 2001). Tuy nhiên sự kết hợp của hai polymer trong nước hoặc một polymer hòa tan trong nước và muối (kali phosphate hay citrate) là phổ biến hơn cả (Cooper & cộng sự, 2006), hệ hai polymer trong nước được sử dụng tốt nhất cho việc tách chiết, làm sạch các chất hòa tan nhạy cảm với môi trường ion vì các ATPS này tạo ra nồng độ ion thấp. Trong khi, nồng độ ion cao là nhược điểm duy nhất của hệ thống polymer-muối (Albertsson, 1958). Các loại khác bao gồm ion lỏng và rượu mạch ngắn. Thêm vào đó, các chất hoạt động bề mặt ion hoặc không ion được sử dụng cho sự hình thành các micell (Hatti- Kaul, 2001).
Polyethylene glycol (PEG) có trọng lượng phân tử khác nhau là các polymer được sử dụng rộng rãi trong ATPE do độc tính thấp, giá thấp và tính chất dễ bay hơi thấp (Zafarani & cộng sự, 2012). Một thành phần chính trong hai pha của ATPS là nước, chúng không những tạo thành môi trường thuận lợi cho các phân tử sinh học được dễ dàng tách ra mà còn giúp ổn định cấu trúc và hoạt tính sinh học của các chất này (Albertsson, 1958).
Do hàm lượng nước cao, ATPE có nhiều ưu điểm so với các kỹ thuật trích ly truyền thống vì chúng đem lại nhiều sự cải tiến và an toàn khi áp dụng với các phần tử sinh học (Cooper & cộng sự, 2006). Thêm vào đó, chúng còn được chứng minh về tính đơn giản, thời
gian thực hiện nhanh, chi phí thấp, có khả năng được ứng dụng trên quy mô lớn (Johanson, 1986).
Mặc dù ATPE là một phương pháp trích ly đơn giản, có tính chọn lọc và chi phí thấp, nhưng cũng có nhiều nhược điểm như sự hiểu biết không rõ ràng về cơ chế tách pha liên quan đến ATPE. Chúng được cải thiện và phát triển bằng cách kết hợp ATPE với nhiều phương pháp khác nhằm mục đích chính là khôi phục các sản phẩm có giá trị cao (Iqbal & cộng sự, 2016).
1.5.3. Giản đồ pha
Giản đồ pha giống như “dấu vân tay” của hệ thống ATPS trong điều kiện cụ thể (ví dụ pH, nhiệt độ). Nó cung cấp một tập hợp thông tin như nồng độ các thành phần cho sự hình thành hai pha và nồng độ của chúng trong pha trên và pha dưới. Biểu đồ (Hình 1.7) cho thấy đường cong binodal (TCB) phân tách dung dịch thành hai pha riêng biệt (phía trên đường cong binodal), hoặc trở lại trạng thái một pha (bên dưới đường cong binodal).
Hình 1.7: Mô hình giản đồ pha
Các tọa độ biểu thị cho những vùng pha trên và pha dưới đạt trạng thái cân bằng đều nằm trên đường TB (thường gọi là tie-line), chúng là đường nối hai nút của đường cong
binodal. Điểm C được gọi là điểm tới hạn, khi dung dịch đạt đến trạng thái này, thành phần, thể tích của pha trên và pha dưới là gần như bằng nhau, do đó tại tọa độ này, độ dài đường tie-line bằng 0 (Raja & cộng sự, 2011).
1.5.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách pha
Trọng lượng phân tử (MW) và nồng độ polymer
Hầu hết các hệ ATPS được tạo thành bởi polymer – polymer/muối. MW polymer ảnh hưởng đáng kể đến sự tách pha. Nhìn chung,
Tăng MW của polymer → giảm nồng độ polymer cần thiết cho sự tạo thành pha
Tăng sự chênh lệch giữa MW của các polymer → tăng sự bất đối xứng của đường
cong giản đồ pha
Tăng MW của PEG → giảm giá trị K
Trong hệ polymer – muối, sự tách pha theo chiều hướng pha giàu polymer giảm khi tăng nồng độ polymer, trong khi hệ polymer – polymer sự tách pha theo chiều hướng giảm về phía polymer có MW cao. Lý do chính cho hiện tượng này là khi tăng nồng độ polymer, tính kỵ nước làm gia tăng sự phân tách đẩy nước khỏi pha giàu polymer và đưa về pha giàu muối, đồng thời tách loại các phân tử sinh học khỏi pha giàu muối đưa về pha giàu polymer. Khi tăng MW của polymer tính kỵ nước tăng lên do giảm các nhóm ưa nước/vùng kỵ nước (Asenjo & cộng sự, 2011).
Tính kỵ nước
Tính kỵ nước đóng vai trò quan trọng trong việc tách pha, đặc biệt với protein. Hai hiệu ứng: hiệu ứng kỵ nước của pha và hiệu ứng tách bằng muối đều liên quan đến các tương tác kỵ nước (Asenjo & cộng sự, 2011). Trong hệ muối - polymer, tính kỵ nước có thể điều khiển bằng cách thay đổi TLL, MW của polymer và bằng cách thêm muối (ví dụ như NaCl). Nồng độ NaCl thấp (<1 M) không ảnh hưởng ATPS tuy nhiên, nồng độ muối cao (>1 M) làm thay đổi giản đồ pha (Andrews & cộng sự, 2010). Việc thêm muối vào hệ ATPS có ảnh hưởng đáng kể đến sự tách pha (Cote & cộng sự, 1974). Các muối chứa ion với độ kỵ nước khác nhau, các ion kỵ nước sẽ bị ép đến pha với mức độ kỵ nước cao hơn và ngược lại. Hiệu
ứng tách bằng muối làm di chuyển các phân tử sinh học từ pha giàu muối sang pha giàu polymer (Raja & cộng sự, 2011).
pH
pH của ATPS có thể làm thay đổi điện tích và tính chất bề mặt của chất tan làm ảnh hưởng đến sự tách các phân tử sinh học. Ví dụ, khi áp dụng ATPE để tách protein, điện tích của protein thay đổi từ âm trong pH cao hơn điểm đẳng điện (pI) sang dương khi thấp hơn pI (Raja & cộng sự, 2011). Các phân tử sinh học tích điện âm hơn khi trong hệ pH cao hơn, điều này làm tăng hệ số phân bố và các phân tử sinh học cần tách sẽ hiện diện chủ yếu ở pha trên. Các giá trị pH cao hơn pI của protein ảnh hưởng đến ái lực với pha giàu PEG do moment lưỡng cực dương (Andrews & cộng sự, 2005).
Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến thành phần hai pha trong hệ ATPS, dẫn đến sự thay đổi giản đồ pha. Những thay đổi về nhiết độ cũng ảnh hưởng sự tách pha thông qua yếu tố độ nhớt và tỷ trọng. Do đó, cần kiểm soát nghiêm ngặt nhiệt độ trong các thí nghiệm liên quan đến hệ ATPS. Nhìn chung, đối với hệ polymer – polymer ATPS có nồng độ polymer thấp thì sự tách pha đạt được ở nhiệt độ thấp, tuy nhiên, hiệu ứng ngược lại trong hệ polymer – muối (Walter & cộng sự, 1994). Sự tách pha của các phân tử sinh học và tốc độ tách pha ảnh hưởng bởi các tính chất hoá lý như tỷ trọng, độ nhớt và sức căng bề mặt của hệ ATPS (Hatti-Kaul, 2001).
Các loại muối
Ảnh hưởng của các loại muối lên quá trình tách pha tuân theo thứ tự được nghiên cứu bởi Hofmeister. Khi xem xét một loại muối, anion đóng vai trò quan trọng hơn cation. Các anion đa hoá trị, như HPO42- và SO42- có hiệu quả nhất trong việc tách pha với hệ có chứa PEG. Việc giải thích sự tách pha của hệ nước – muối – PEG liên quan đến mức độ thay thế các liên kết hydrate hoá giữa cation và nước bằng các liên kết cation với oxygen ether trong PEG. Các muối, với anion đa hoá trị có kích thước nhỏ có mật độ điện tích cao, tham gia vào sự thay thế các liên kết dạng này với mạch polymer, dẫn đến sự hình thành các vùng tách muối và sự tách pha diễn ra (Huddleston & cộng sự, 1990).
1.5.5. Trích ly 2 pha nước với hệ PEG/muối
Như đã nói ở trên, ATPS là một trong những hệ thống phù hợp nhất để phân tách, tinh chế các phần tử sinh học. Gần đây ATPS polymer-muối đặc biệt là polyethylene glycol (PEG) và muối đã được áp dụng nhiều hơn cả (Rosa & cộng sự, 2010). PEG-muối có các ưu điểm đáng chú ý như tiết kiệm chi phí, độ nhớt thấp, tốc độ tách pha nhanh, do đó dễ dàng áp dụng trên quy mô công nghiệp (Kroner & cộng sự, 1982).
Hệ hai pha PEG/muối có thể được hình thành bằng cách trộn PEG và muối trong nước để thu được hỗn hợp có trạng thái đục bền vững (Albertsson, 1986), với pha trên giàu PEG và pha dưới giàu muối. Ảnh hưởng của các loại muối lên hiệu suất quá trình tách pha tuân theo thứ tự được quy định trong thứ tự được quy định bởi Hofmeister, trong đó các anion đóng vai trò quan trọng hơn cation trong việc quyết định hiệu quả tách pha của hệ. HPO42- và SO42- là một trong hai ion đa hóa trị có hiệu quả nhất trong việc tách pha với PEG (Abbot, 1990). Mặc dù vậy, cơ chế hình thành pha đến nay vẫn chưa được giải thích rõ ràng. (Chan-Wha Kim & cộng sự, 2000).
1.6. Các nghiên cứu trong nước và ngoài nước về trích ly betacyanin và pectin
1.6.1. Tình hình nghiên cứu betacyanin và pectin trong nước
Betacyanin có trong nhiều các loại thực vật như thanh long, xương rồng, củ cải đường, rau dền,…đây là một nguồn nguyên liệu dồi dào để trích được betacyanin. Việt Nam hiện cũng có một số nghiên cứu về phương pháp trích ly betacyanin từ các nguồn thực vật bằng các phương pháp khác nhau. Nhưng các nghiên cứu đa phần trên nguyên liệu là củ dền, tuy nhiên vỏ thanh lỏng cũng là một nguồn nguyên liệu chứa sắc tố betacyanin. Mạc Xuân Hoa đã trích ly betacyanin từ vỏ thanh long ruột trắng bằng phương pháp vi sóng và siêu âm. Với phương pháp vi sóng, hiệu quả trích ly betacyanin cao nhất 0.456 mg/100g được xác định ở thời gian 30 giây và mức năng lượng 600 W. Đối với trích ly siêu âm được được hiệu quả là 0.409 mg/100 g trong thời gian 10 phút và mức năng lượng 187.5 W (Mạc Xuân Hoa & cộng sự, 2017). Hầu hết các nghiên cứu trích ly betacyanin đều từ vỏ thanh long ruột trắng với kỹ thuật trích ly với dung môi lỏng thông thường. Hiện tại đã có nghiên cứu trích ly betacyanin bằng phương pháp ATPE từ vỏ thanh long ruột đỏ, vỏ thanh long ruột đỏ có màu hấp dẫn chứa các sắc tố betacyanin và là một nguồn nguyên liệu phụ thu dồi dào để trích ly betacyanin. Theo nghiên cứu của Trần Minh Tiến đã tiến hành trích ly betacyanin từ vỏ
thanh long ruột đỏ bằng hệ thống hai pha nước ethanol-amonium sulfate, kết quả thu được hiệu suất thu hồi betacyanin đạt 85,07±1,16% tương ứng với hàm lượng betacyanin thu được là 6,16 mg.L-1 với các điều kiện trích ly tối ưu (Trần Minh Tiến, 2018). Đây là phương pháp mới ít được tiến hành nghiên cứu ở Việt Nam nhưng với phương pháp này sẽ nâng cao hiệu suất trích ly cũng như tinh sạch hợp chất hơn so với các phương pháp thông thường.
Nhờ những ứng dụng phổ biến trong cả y học và công nghệ thực phẩm, pectin được nhiều nước trong đó có Việt Nam quan tâm và nghiên cứu sử dụng. Một số công trình nghiên cứu trích ly pectin bước đầu đã đem lại thành công nhất định. Đó là nghiên cứu của Trần Thị Định trong nghiên cứu tối ưu hóa hóa các điều kiện trích ly pectin từ vỏ thanh long: với dung môi trích ly là acid citric 40% tại pH = 3.5, kích thước nguyên liệu ≤ 1 mm, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 34.23/1 (v/w), nhiệt độ trích ly là 85ºC, thời gian trích ly là 35 phút, hiệu suất pectin thu được sau cùng là 13.8% (Trần Thị Định, 2016). Ở một nghiên cứu khác của Bùi Anh Võ cùng cộng sự về trích ly pectin bằng cách sử dụng dung dịch acid H2SO4, bột vỏ được rây qua rây có kích thước 0.7×0.7 mm, tỉ lệ dung môi/bột vỏ là 19/1, nhiệt độ trích ly là 100ºC, thời gian trích ly là 1 giờ tại pH = 1, kết quả báo cáo rằng hiệu suất đạt 17.06% (Bùi Anh Võ & Nguyễn Đức Lượng, 2009). Trong nghiên cứu trích ly pectin được thực hiện đồng thời với tách sắc tố chlorophyll, hiệu suất trích ly pectin thu được đạt 9.63%, mức độ ester hóa là 77.11%, đã được Tạ Duy Tiến cùng cộng sự thực hiện trên lá dây hoàng thanh
Cocculus sarmentosus trong điều kiện sử dung dịch acetone 90% để thu được phần rắn dùng
để trích ly pectin và xử lý với HCl pH=3 tại 75 - 85ºC. (Tạ Duy Tiên & cộng sự, 2008). Những nghiên cứu trên đây đã đặt những nền tảng cơ bản cho ngành công nghiệp trích ly pectin tại nước ta.
Tuy nhiên, hiện trong nước chưa có nghiên cứu vừa trích ly betacyanin và pectin, trong khi nếu sử dụng phương pháp ATPE có thể thu nhận được pectin từ pha dưới, betacyanin ở pha trên. Chính vì thế đây là một phương pháp cần được quan tâm để có thể mở rộng phương pháp nghiên cứu nhằm trích ly đồng thời được nhiều nhóm hợp chất có giá trị.
1.6.2. Tình hình nghiên cứu betacyanin và pectin ngoài nước
Đã có rất nhiều nghiên cứu trích ly betacyanin bằng các phương pháp như phương pháp sử dụng dung môi (Azeredo, 2009), phương pháp hỗ trợ sóng siêu âm (Esclapez & cộng sự, 2011), phương pháp trích ly bằng dung môi lỏng siêu tới hạn (Cardoso-Ugarte &
cộng sự, 2014),… tuy nhiên các phương pháp này còn nhiều hạn chế trong việc tinh sạch cũng như là hiệu suất thu hồi betacyanin. Phương pháp ATPE được xem là một phương pháp mới khắc phục được các nhược điểm của các phương pháp thông thường. Đối với việc trích ly betacyanin bằng phương pháp ATPE đã được áp dụng với một số hệ khác nhau như ethanol/muối, polymer/muối,…nhưng vẫn còn tương đối hạn chế (J. Chandrasekhar & cộng sự, 2013). Betacyanin được trích ly từ củ cải đường theo phương pháp ATPE với hệ PEG/muối thu được betalain (70-75%) (Chethana & cộng sự, 2007).
Quá trình trích ly pectin đã và đang ngày càng phổ biến trên toàn thế giới. Một ví dụ điển hình đó là báo cáo từ Abid và cộng sự, khi họ nghiên cứu ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, thời gian trích ly đến năng suất của pectin từ vỏ cam. Với vỏ cam nghiền mịn được ngâm trong dung dịch acid sulfuric 0.1N, pH 2.5 ở 80°C trong 120 phút, hiệu suất thu được là 16.1%. (Abid và cộng sự, 2009). Được tin là một nguồn nguyên liệu dồi dào cho ngành công nghiệp sản xuất pectin, vỏ thanh long cũng đã được sử dụng trong nhiều công trình nghiên cứu. Một trong những nghiên cứu đó là của Ismail và cộng sự, về trích ly và tính chất của pectin thu được trên vỏ thanh long ruột đỏ. Trong nghiên cứu này vỏ thanh long được xử lý riêng bằng 0.25% ammonium oxalate/acid oxalic, HCl 0.03M tại pH = 4.6 ở 86ºC và nước khử ion. Hiệu suất trích ly thu được dao động từ 14.96%-20.14% tính theo trọng lượng khô (Ismail & cộng sự, 2012). Trong một nghiên cứu khác về quá trình trích ly pectin với sự hỗ trợ của vi sóng (MAE), nghiên cứu được khảo sát trong các điều kiện 300, 450, 600 W thời gian 5-10 phút, hiệu suất thu hồi pectin cao nhất đạt 23.11% ở 600 W. Mặc dù có nhiều ưu điểm như thời gian thực hiện nhanh, tiết kiệm được dung môi cũng như có thể mở rộng trên quy mô lớn, tuy nhiên MAE đã được báo cáo rằng pectin bị suy giảm tính chất khi tiếp xúc với các tia phóng xạ (Maran & cộng sự, 2014).
Hiện tại chưa tìm thấy các báo cáo nghiên cứu về việc sử dụng phương pháp ATPE để cùng thu nhận betacyanin và pectin từ vỏ thanh long ruột đỏ cũng như từ các nguyên liệu khác. Chính vì thế, việc sử dụng phương pháp ATPE trong trích ly các chất màu và các hoạt tính sinh học cần được quan tâm.
1.7. Định hướng nghiên cứu trích ly từ vỏ thanh long ruột đỏ
Việc trích ly betacyanin từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau đã rất phổ biến bằng nhiều kỹ thuật trích ly khác nhau. Tuy nhiên đa phần các nghiên cứu đều tập trung trên nguyên liệu củ cải đường. Mặc khác với nguyên liệu củ cải đường chứa một hàm lượng
nitrate và nitrite đáng kể là điều kiện để hình thành các nitrosamine gây ưng thư. Vì vậy cần phải tốn chi phí loại bỏ lượng nitrite, tuy nhiên việc làm giảm hàm lượng nitrite là một trở ngại lớn. Trong khi đó thanh long ruột đỏ được phát hiện là một nguồn nguyên liệu chứa betacyanin dồi dào với một hàm lượng lớn betacyanin cả trong thịt quả và vỏ của thanh long ruột đỏ (35.95 ± 3.48 mg.100 g-1) (Tấn & Hằng, 2014). Với nguồn nguyên liệu là thanh long ruột đỏ, phần quả thịt được sử dụng để sản xuất ra nhiều loại thực phẩm như mứt, nước