Dịch trích betacyanin thu được sau quá trình trích ly sẽ được phân bố khác nhau giữa 2 pha trên và dưới của hệ. Hiệu quả của quá trình trích ly được tính toán và đánh giá dựa vào các thông số tỷ lệ thể tích pha (R), hệ số phân bố betacyanin (K), hiệu suất thu hồi betacyanin (Y).
Xác định tỷ lệ thể tích pha (R)
Tỷ lệ thể tích pha (R) được định nghĩa là tỷ lệ của thể tích pha trên (VT) và thể tích pha dưới (VB) và được xác định bằng công thức:
𝑅 = 𝑉𝑇
𝑉𝐵 (2.11)
Trong đó: VT, VB (mL) lần lượt là thể tích của pha trên và pha dưới.
Xác định hệ số phân bố betacyanin (K)
Hệ số phân bố betacyanin (K) được xác đinh theo công thức:
𝐾 = 𝐶𝑇
𝐶𝐵 (2.12)
Trong đó: CT, CB (mg.L-1) lần lượt là nồng độ cân bằng của betacyanin ở pha trên và pha dưới.
Xác định hiệu suất thu hồi betacyanin (Y)
Hiệu suất thu hồi betacyanin ở pha trên được tính theo các công thức sau:
𝑌 = 𝐶𝑇×𝑉𝑇
𝐶𝑇×𝑉𝑇+𝐶𝐵×𝑉𝐵× 100 (2.13) Trong đó: Y là hiệu suất thu hồi betacyanin ở pha trên;
CT, CB (mg.L-1) lần lượt là nồng độ cân bằng của betacyanin ở pha trên và pha dưới;
2.2.6. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng của quá trình trích ly
Xây dựng giản đồ pha
Giản đồ pha được xây dựng bằng phương pháp chuẩn độ độ đục theo nghiên cứu của của M.Dekker (M.Dekker & công sự, 1995). Mỗi hệ ATPS được đặc trưng bởi một giản đồ pha duy nhất (Mujahid Iqbal, 2016). Giản đồ pha được trình bày trên đồ thị dưới dạng đường cong binodal, phân chia thành 2 vùng tương ứng với 2 pha của ATPS.
Hệ ATPS được xây dựng bao gồm hệ hữu cơ, H2O và muối. Các loại muối có thể
được sử dụng trong hệ bao gồm (NH4)2SO4, MgSO4 và KH2PO4, K2HPO4, Na2CO3,…. Và hệ hữu cơ được chọn là Polymer Ethylene Glycol bao gồm các PEG (6000, 4000, 1000, 400,…). Polymer là PEG 6000 được chọn để thực hiện nghiên cứu, theo J. Chandrasekhar qua thực nghiệm, việc sử dụng PEG 6000 cho hiệu suất trích ly betacyanin cao hơn sao với các loại PEG có trọng lượng phân tử khác (PEG 40000, 1000, 400...) (J. Chandrasekhar và cộng sự, 2013). Mặc khác đối với việc trích ly pectin bằng phương pháp hai pha nước với hệ pha polymer/muối hiện tại chưa có nghiên cứu.
Các bước xây dựng giản đồ pha (M.Dekker và công sự, 1995):
- Bước 1: một lượng PEG 6000 được hòa tan hoàn toàn với nước cất để được nồng độ
bão hòa.
- Bước 2: Cho vào bình tam giác một lượng cố định là 5 mL dung dịch PEG 6000 bão
hòa. Đặt bình tam giác lên cân và ghi nhận khối lượng.
- Bước 3: Hòa tan muối vào nước cất để được dung dịch muối bão hòa.
- Bước 4: Từ từ cho dung dịch muối vào bình tam giác chứa PEG lắc cho đến khi đạt
trạng thái đục bền vững. Ghi nhận khối lượng hỗn hợp PEG và muối. Khối lượng từng phần PEG và muối của hệ thống được tính toán. Phần trăm khối lượng của các thành phần tại ngay điểm đục là đại diện một điểm trên đường cong binodal.
- Bước 5: Sau đó tiếp tục thêm H2O cho đến khi hiện tượng đục biến mất. Ghi nhận khối lượng để tính toán được khối lượng nước đã thêm. Tiếp theo là tiếp tục thêm dung dịch muối bão hòa để đạt được độ đục lần nữa. Cân khối lượng và tính toán % các thành phần để thu được các điểm xây dựng đường cong binodal cho ATPS. Tiếp tục làm tương tự cho đến khi lượng muối thêm vào quá lớn mà không có xuất hiện
trạng thái đục thì dừng thí nghiệm. Ghi nhận khối lượng PEG 6000, muối và nước ở từng điểm đục, tính toán tỉ lệ phần trăm PEG, muối và nước (w/w).
Khảo sát lựa chọn muối
Theo nghiên cứu của Thomas Reschke cho thấy các loại muối có thể sử dụng với hệ pha cùng với PEG 6000 bao gồm các muối (NH4)2SO4, MgSO4 và KH2PO4, K2HPO4, Na2CO3 (Thomas Reschke & cộng sự, 2013). Khảo sát chọn muối là bước quan trọng để xác định chính xác một muối duy nhất cho hệ ATPS để thực hiện nghiên cứu. Các bước khảo sát chọn muối được thực hiện trong ống nghiệm. Khối lượng của muối, PEG và nước để đưa ra khảo sát được dựa trên giản đồ pha. Một lượng muối và PEG được cho vào ống nghiệm cùng với một lượng nước được tính toán. Lắc đều cho đến khi muối và PEG tan hoàn toàn. Sau đó cho 0.05 g mẫu bột vỏ thanh long, tổng khối lượng các thành phần trong hệ là 10 g. Dựa trên kết quả beatacyanin và pectin thu được để so sánh và lựa chọn muối phù hợp cho quá trình trích ly (Cheng và cộng sự, 2017). Tách hai pha theo quy trình (a) và đánh giá hiệu quả trích ly theo quy trình (b) dưới đây.
(a) Quy trình thí nghiệm phân tách hai pha
Cho vào ống nghiệm: khối lượng muối, PEG 6000 và nước theo tính toán cho từng thí nghiệm. Sau khi tiến hành các bước chuẩn bị mẫu, sau đó lắc các mẫu bằng máy lắc trong 15 phút, tốc độ 450 vòng/phút. Để ống nghiệm trên giá, quan sát quá trình tách pha sau 30 phút. Sau đó tiến hành quá trình tách và xác định thể tích của 2 pha.
(b)Quy trình thí nghiệm xác định hiệu quả trích ly
Đối với chất màu betacyanin, tiến hành đo độ hấp thụ của pha trên và pha dưới ở bước sóng 538 nm. Tính toán hiệu suất betacyanin thu được.
Đối với pectin, tiến hành quá trình ly tâm loại bã – loại bỏ PEG bằng cách sử dụng chloroform – ngâm cồn 80 độ - lọc – cân – sấy để thu hồi pectin. Cân khối lượng pectin sau khi sấy đến khối lượng không đổi. Tính toán khối lượng pectin thu được.
Khảo sát lựa chọn ngưỡng trích ly
Sau khi đã xác định được muối cho hệ ATPS, tiến hành thực nghiệm để xác định ngưỡng trích ly. Các thí nghiệm được thực hiện trong ống nghiệm với các tỷ lệ PEG và tỷ lệ muối được xác định dựa trên giản đồ pha. Cho vào các ống nghiệm khối lượng PEG và muối
theo tỷ lệ khối lượng trên giản đồ pha được tính toán sẵn. Tiến hành cân khối lượng mẫu và định mức nước cất đến 10% (w/w) và thực hiện các bước tương tự quy trình thí nghiệm phân tách hai pha. Sau đó quan sát sự tách pha của các ống nghiệm sau 30 phút, quan sát được các hiện tượng qua từng các ống nghiệm để từ đó xác định được ngưỡng trích ly cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.7. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly
Khảo sát các điều kiện trích ly
Dựa trên kết quả lựa chọn muối và xác định được ngưỡng trích ly, để cho quá trình trích ly đạt hiệu suất tối ưu cần tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng. Các yếu tố được khảo sát trong nghiên cứu bao gồm: tỷ lệ muối, tỷ lệ PEG, tỷ lệ nguyên liệu, pH và nhiệt độ của ATPS. Việc khảo sát các yếu tố để đưa ra lựa chọn tối ưu nhất cho quá trình trích ly, vừa thu được lượng betacyanin cao vừa có thể phụ thu được lượng pectin ở pha dưới.
Các ngưỡng khảo sát của từng yếu tố:
- Tỷ lệ muối (w/w): 7.75%, 8.00%, 8.25%, 8.50%, 9.00%, 9.50%, 10.00%, 10.50%,
11.00% (được xác định bằng thực nghiệm).
- Tỷ lệ PEG 6000 (w/w): 12.0%, 12.5%, 13.0%, 13.5%, 14.0%, 14.5%, 15.0% (được
xác định bằng thực nghiệm).
- Tỷ lệ nguyên liệu (bột vỏ thanh long) (w/w): 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%
(Wu & cộng sự, 2011).
- Nhiệt độ của hệ: 30oC, 35oC, 40oC, 45oC, 50oC, 55oC (Chandrasekhar & cộng sự, 2015).
- pH của hệ: 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 (Chandrasekhar & cộng sự, 2015).
Khảo sát tỷ lệ muối (w/w)
Tiến hành khảo sát lựa chọn tỉ lệ muối cho quá trình trích ly. Với muối đã lựa chọn là (NH4)2SO4 và dựa trên quá trình thực nghiệm, tỷ lệ muối (w/w) được khảo sát nằm trong ngưỡng 7.75% đến 11.00%. Ở tỷ lệ muối dưới 7.75% hỗn hợp dung dịch bao gồm hệ ATPS và vỏ thanh long không tách pha. Và tỷ lệ muối trên 11.00% khối lượng muối lớn khiến cho muối khó tan hết trong hệ ATPS. Khảo sát tỷ lệ muối được tiến hành như sau:
Cân chính xác 2.6 g PEG 6000, 0.1 g nguyên liệu và khối lượng muối lần lượt theo tỷ lệ khối lượng (7.75%, 8.00%, 8.25%, 8.50%, 9.00%, 9.50%, 10.00%, 10.50%, 11.00%
(w/w)) vào cốc 100 mL. Sau đó thêm nước cất vào để hỗn hợp vừa đủ 20 g. Sau đó hòa tan hoàn toàn PEG và muối rồi tiến hành lắc trên máy lắc 15 phút với tốc độ 450 vòng/phút. Để yên và quan sát quá trình tách pha trong 30 phút. Sau đó tiến hành quá trình tách bằng phiễu chiết và xác định thể tích của 2 pha. Tiến hành các bước tự quy trình thí nghiệm xác định hiệu quá trích ly.
Khảo sát tỷ lệ PEG 6000
Sau khi xác định được tỷ lệ muối phù hợp cho quá trình trích ly dựa vào giản đồ pha và thực nghiệm, tiến hành khảo sát tỷ lệ PEG 6000. Đối với tỷ lệ PEG dưới 12% hoặc trên 15% không xảy ra quá trích tách pha.
Với ngưỡng tỷ lệ PEG 6000 khảo sát lần lượt là (12.0%, 12.5%, 13.0%, 13.50%, 14.0%, 14.5%, 15.0% (w/w)). Cân khối lượng muối theo tỷ lệ muối đã được xác định và các bước được tiến hành tương tự như khảo sát tỷ lệ muối. Dựa trên kết quả beatacyanin và pectin thu được để so sánh và lựa chọn tỷ lệ PEG 6000 phù hợp cho quá trình trích ly.
Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu
Sau khi lựa chọn được tỷ lệ muối và PEG phù hợp cho quá trình trích ly. Dựa vào tỷ lệ xác định được tiến hành các bước tương tự để khảo sát lựa chọn tỷ lệ nguyên liệu. Trong các khảo sát trước đó, tỷ lệ nguyên liệu bột vỏ thanh long sử dụng là 0.50% (tức đã loại đi % lượng nước có trong vỏ thanh long). Thực hiện khảo sát với các tỷ lệ khác nhau lần lượt là (0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8% (w/w)). Tính toán và đưa ra tỷ lệ thích hợp.
Khảo sát nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến hiệu suất thu hồi betacyanin, vì betacyanin kém bền màu ở nhiệt độ cao (Chandrasekhar & cộng sự, 2015). Các ngưỡng nhiệt độ khảo sát lần lượt là (30oC, 35oC, 40oC, 45oC, 50oC, 55oC), tiến hành các thí nghiệm tương tự như các thí nghiệm tỷ lệ muối, PEG để đưa ra nhiệt độ tối ưu nhất cho quá trình trích ly.
Khảo sát pH
Sau khi xác định được nhiệt độ thích hợp, tiến hành thí nghiệm tương tự như các các thí nghiệm tỷ lệ muối. pH được khảo sát của hệ là (4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 (Chandrasekhar & cộng sự, 2015).). Tính toán và xác định giá trị pH tối ưu cho quá trình trích ly. pH của hệ được điều chỉnh với dung dịch HCl 1N và NaOH 1N.
2.2.8. Phương pháp khảo sát điều kiện bảo quản dịch trích betacyanin
Theo nghiên cứu của Herbach betacyanin nhạy cảm với các yếu tố về: nhiệt độ, ánh sáng. Vì thế tiến hành khảo sát độ bền màu của betacyanin theo thời gian và nhiệt độ ở các điều kiện khác nhau.
Thí nghiệm khảo sát sự thoái biến betacyanin khi có không bổ sung acid ascorbic
Thời gian khảo sát là 7 ngày, dịch trích betacyanin được khảo sát ở các điều kiện sau:
- Nhiệt độ phòng, ánh sáng tự nhiên (Mẫu 1.1)
- Nhiệt độ phòng, trong bóng tối (Mẫu 1.2) - Nhiệt độ 4oC, có ánh sáng (Mẫu 1.3) - Nhiệt độ 4oC, trong bóng tối (Mẫu 1.4)
Cách tiến hành: Chuẩn bị 4 bình erlen đã được sấy khô và hút ẩm. Cho vào mỗi bình erlen 20 mL dịch trích betacyanin đã được trích ly trong điều kiện đã được xác định qua các khảo sát. Bịt kín miệng erlen bằng màng bọc thực phẩm và giấy bạc. Các điều kiện khảo sát được tiến hành như sau:
- Nhiệt độ phòng, ánh sáng tự nhiên
- Nhiệt độ phòng, trong bóng tối: mẫu được bọc giấy bạc và để ở nhiệt độ phòng - Nhiệt độ 4oC, có ánh sáng: mẫu được để trong tủ mát có ánh sáng
- Nhiệt độ 4oC, trong bóng tối: mẫu được bọc kín bằng giấy bạc và để trong tủ mát Cứ sau 24 giờ tiến hành quan sát và đo độ hấp thụ của dịch trích ở bước sóng 538 nm.
Lượng betacyanin còn lại trong dung dịch được xác định theo công thức (2.10)
%betacyanin còn lại = nồng độ betacyanin còn lại
nồng độ betacyanin ban đầu× 100% (2.10)
Thí nghiệm khảo sát sự thoái biến betacyanin khi bổ sung acid ascorbic
Tiến hành các thí nghiệm tương tự như trên và có bổ sung 0.25% ascorbic acid 0.23% (w/w) (Tang & Norziah, 2007). Tính toán, so sánh kết quả để rút ra kết luận về sự thay đổi độ bền màu betacyanin khác nhau khi khảo sát ở các điện kiện.
2.2.9. Ứng dụng betacyanin và pectin vào thực phẩm
2.2.9.1. Ứng dụng của betacyanin trong thực phẩm
Betacyanin là sắc tố kém bền với nhiệt, vì thế không thể sử dụng với các sản phẩm chế biến ở nhiệt độ cao. Ngoài ra, betacyanin chỉ ổn định ở pH thấp (pH<7). Do đó, có thể sử dụng betacyanin cho các sản phẩm có pH aicd và ở nhiệt độ lạnh như sữa chua, kem, nước giải khát, sản phẩm rau câu,…Sản phẩm sữa chua đang là sản phẩm phổ biến được người tiêu dùng quan tâm và tin dùng. Sữa chua là một sản phẩm có nguồn gốc hoàn toàn từ thiên nhiên. Theo các chuyên gia, nên dùng ít nhất 1 hũ sữa chua mỗi ngày để đáp ứng đủ nhu cầu đường, đạm, vitamin, calcium… hàng ngày của cơ thể. Đồng thời, giúp hệ miễn dịch tốt hơn, cải thiện chức năng tiêu hóa, làm răng và xương chắc khỏe.
Quá trình lên men tự nhiên đã chuyển hóa lactose - chất khó hấp thu trong sữa tươi thành acid lactic - chất dễ hấp thu. Chính vì thế, phụ nữ mang thai và những người bất dung nạp lactose hoàn toàn có thể sử dụng sữa chua để bổ sung các thành phần dinh dưỡng có trong sữa. Viêc bổ sung chất màu được trích ly từ nguồn gốc tự nhiên giúp sản phẩm sữa chua tăng thêm giá trị cảm quan, màu sắc hấp dẫn cho sản phẩm. Ngoài ra betacyanin là một chất có hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng. Vì vậy sản phẩm ứng dụng chất màu betacyanin trong nghiên cứu lựa chọn là sữa chua.
Quy trình ứng dụng được thể hiện trong Hình 2.7 Nguyên liệu (sữa có đường Phối trộn Gia nhiệt 60ºC Sữa chua dẻo Đồng hóa Hạ nhiệt 40ºC Ủ Rót hũ Cấy men Dịch trích betacyanin Hũ, nắp Giống Làm lạnh
Thuyết minh quy trình:
Nguyên liệu
Mục đích: Chuẩn bị nguyên liệu cho quy trình sản xuất và đảm bảo chất lượng sản phẩm
Cách thực hiện: Chuẩn bị nguyên liệu bao gồm sữa tươi có đường (hoặc không đường), sữa đặc. Kiểm tra hạn sử dụng, chất lượng nguyên liệu.
Phối trộn
Mục đích: Hòa tan hoàn tàn các nguyên liệu và đồng nhất hỗn hợp.
Cách thực hiện: Sữa tươi, sữa đặc, dịch trích betacyanin phối ở nhiệt độ 45oC. Sữa tươi và sữa đặc được cho vào để đạt nồng oBrix 8-10%. Sau đó cho dịch trích betacyanin với một lượng bằng 1/40 thể tích hỗn hợp để quá trình hòa tan đồng đều.
Gia nhiệt
Mục đích: Chuẩn bị cho quá trình đồng hóa Cách thực hiện: Nâng nhiệt độ lên 60-70oC
Đồng hóa
Mục đích: Phá vỡ các hạt béo vào trong nguyên liệu và phân tán các chất khác nhau tạo thành hỗn hợp đồng nhất.
Cách thực hiện: Nhiệt được nâng cao, dựa vào chuyển động khi có nhiệt độ tạo thành hỗn hợp đồng nhất.
Hạ nhiệt và cấy men
Mục đích: Hạ nhiệt với mục đích tạo nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men của vi khuẩn lactic (43ºC). Cấy men để giống hoạt động cho quá trình lên men.
Cách thực hiện: Hạ nhiệt độ xuống 43ºC. Sau đó sử dụng giống lên men (sữa chua cái) để phối trộn đều vào hỗn hợp với pH 4.4-4.5.
Rót hũ
Mục đích: Cố định hình dạng của hỗn hợp và chuẩn bị cho quá trình ủ.
Cách tiến hành: Cách dụng cụ phải được tiệt trùng và để ráo. Tiến hành rót hỗn hợp vào từng hũ cố định rồi đậy nắp lại.
Ủ
Mục đích: Tạo điều kiện thích hợp cho quá trình lên men chuyển hóa đường lactose thành acid lactic. Và tạo sản phẩm chất lượng.
Cách tiến hành: Ủ ở 32-48oC; 8-10 giờ, pH sau ủ khoảng 4.7 – 4.8.
Làm lạnh
Mục đích: Tạo cấu trúc ổn định, và bảo quản được lâu hơn vì sẽ giúp cho quá trình