TÍNH
Ở thực vật bậc cao phơi là sản phẩm tự nhiên của quá trình thụ tinh trong sinh sản hữu tính. Tuy nhiên, phơi cũng cĩ thể hình thành từ các tế bào soma qua quá trình nuơi cấy in vitro. Phơi loại này được gọi là phơi vơ tính (somatic embryos).
Phát sinh phơi vơ tính là sự phát triển phơi từ các tế bào và mơ soma trong các hệ thống nuơi cấy in vitro. Đầu tiên, trong nghiên cứu các hệ thống huyền phù Steward đã phát hiện được rằng các tế bào cà rốt khi xử lý bằng sữa dừa sẽ ngừng phân chia và phân hĩa thành các cấu trúc tương tự như phơi cĩ tên gọi là embryoid. Cũng vào thời gian này Reinert độc lập phát hiện hiện tượng như vậy ở cà rốt nuơi trên thạch cĩ sử dụng các nồng độ auxin như yếu tố gây cảm ứng. Từ đĩ các mơ đặc trưng thuộc các lồi khác nhau được tìm thấy cĩ khả năng tạo phơi vơ tính trong các hệ thống nuơi cấy hoặc cĩ thể được cảm ứng tạo phơi vơ tính bằng cách xử lý đặc biệt đối với mơi trường. Phơi vơ tính phát triển thơng qua các giai đoạn tương tự như phơi hình thành từ hợp tử. Tuy nhiên, kích thước cuối cùng của lá mầm thường nhỏ và khơng cĩ sự phát triển của phơi nhũ hoặc vỏ hạt. Các gen kéo theo khả năng tạo phơi vơ tính và sự điều hịa hoạt động của các gen là như nhau ở phơi vơ tính và phơi hữu tính.
Phơi vơ tính tạo ra tiềm năng sản xuất hàng loạt cây con như những cây sinh ra từ hạt giống. Cây giống được tạo ra bằng phương pháp này bao gồm các loại cây trồng ngồi đồng (lúa, cỏ linh lăng, đậu tương, cây ăn quả), các loại rau (cà rốt, cần tây, xà lách), Cây trồng trên đồn điền (cọ dầu, cà phê) và các loại cây rừng. Để biến khả năng này thành hiện thực phải giải quyết tồn bộ các vấn đề kỹ thuật và chế tạo các phương tiện nuơi trồng. Vấn đề biến đổi tính di truyền trong số cây con tạo ra cần phải cĩ sự hiểu biết sâu sắc và cĩ biện pháp kiểm tra cẩn thận. Dù sao, sử dụng quy trình này là rất hứa hẹn đối với nhiều loại cây trồng.
Phát sinh phơi vơ tính cĩ thể hữu ích đối với việc tách các biến đổi tính di truyền của các dịng vơ tính bên trong tập đồn các tế bào nhằm mục đính hồn thiện tính di truyền của cây giống. Cơng việc này cĩ thể thực hiện được do nguồn gốc tế bào đơn của phơi vơ tính. Tính biến đổi của các dịng vơ tính đơi khi được di truyền bên trong cây nguồn xuất phát từ các hệ thống sinh callus, được cảm ứng bởi các mutagent hoặc được tạo ra bằng cơng nghệ gen.
Phơi vơ tính phát triển từ một số tế bào. Điều này làm cho chúng trở thành mục tiêu hấp dẫn để thực hiện biến đổi tính di truyền. Một trong những phương pháp biến đổi tính di truyền của những tế bào này là phương pháp sử dụng súng bắn gen. Sự tái sinh các phơi vơ tính từ những tế bào này sẽ tạo ra được những cây cĩ tính di truyền đã biến đổi.
Quy trình tạo phơi vơ tính được xác lập đối với từng kiểu gen. Thơng thường, quy trình này bao gồm các giai đoạn sau đây:
+ Giai đoạn 1: Chọn cây giống cĩ vật liệu nuơi cấy thích hợp: Việc chọn nguồn vật liệu nuơi cấy là quyết định quan trọng nhất và địi hỏi sự phân tích chu đáo khả năng tạo phơi của các nguồn mẫu cấy khác nhau trong cây làm giống. Giai đoạn này bao gồm các cơng việc tạo callus, tạo huyền phù tế bào hoặc tạo protoplast bằng các phương pháp mơ tả trong giáo trình này.
+ Giai đoạn 2: Cảm ứng khả năng tạo phơi trong các tế bào nuơi cấy. Việc cảm ứng là rất cần thiết đối với nhĩm tế bào và mẫu cấy khơng cĩ khả năng tạo phơi. Sự cảm ứng được thực hiện bằng cách chuyển các tế bào cần cảm ứng sang mơi trường cơ bản cĩ nồng độ auxin cao. Loại auxin cĩ hiệu quả nhất là 2,4-D hoặc hỗn hợp sữa dừa với nồng độ thấp của NAA. Sau một hoặc hai tuần một số tế bào tiền phơi cĩ thể xuất hiện. Những khối tế bào và tiền phơi lớn cĩ thể được tách ra dựa vào sự khác biệt về kích thước để chuyển sang mơi trường phân hĩa. Những tế bào nhỏ hơn cĩ thể được cấy chuyền để tiếp tục sản xuất phơi vơ tính.
+ Giai đoạn 3:Phân hĩa và sự thành thục của phơi vơ tính. Sau khi cảm ứng khả năng tạo phơi vơ tính trong mơi trường chứa auxin, khối tế bào tiền phơi được chuyển sang mơi trường cơ bản cĩ hàm lượng nitơ cao và khơng chứa auxin. Phơi vơ tính xuất hiện từ các tế bào đơn trong khối tế bào nuơi cấy, phát triển tính phân cực và tiếp theo là quá trình giống như tạo phơi bình thường. Sự phát triển cĩ thể thay đổi về tốc độ và mức độ xuất hiện các biểu hiện khơng bình thường với các phơi thứ cấp hình thành trên phơi sơ cấp. Tính đồng bộ và sự phát triển bình thường cĩ thể đạt được bằng cách ly tâm theo tỷ trọng để tách các khối tiền phơi theo các kích thước khác nhau. Bổ sung acid abscisic vào mơi trường sẽ làm tăng tính đồng nhất và đẩy mạnh sự phát triển bình thường của phơi.
+ Giai đoạn 4: Tạo cây con. Các phơi vơ tính thành thục cĩ kích thước bình thường cĩ thể được đặt lên mơi trường thạch khơng cĩ bất kỳ loại auxin nào nhưng chứa cytokinin nồng đợ thấp để tái sinh cây con hồn chỉnh.
+ Giai đoạn 5:Đưa cây con ra vườn ươm. Sau khi lá và rễ đã hình thành cây con cần được đưa ra vườn ươm và chăm sĩc như mọi cây con khác.
Một sự tiến bộ đáng kể đã được thực hiện nhờ sáng chế và sử dụng các bình phản ứng kích thước lớn để tái sinh phơi tương tự như các thiết bị lên men hoặc thiết bị nuơi cấy số lượng lớn vi sinh vật và tế bào để tạo ra các sản phẩm cơng nghiệp hoặc dược liệu
Chúng ta sẽ làm quen với phương pháp nhân giống bằng cách tạo phơi vơ tính trong ống nghiệm qua ví dụ đối với cây cà phê.
Các phơi vơ tính cà phê cĩ màu trắng, ban đầu hình cầu nhỏ, sau đĩ biến đổi thành dạng tim, thủy lơi, và cuối cùng là sự xuất hiện hai lá sị xanh và hệ rễ. Sự phát triển của phơi vơ tính cà phê rất giống với sự phát triển của phơi hữu tính từ hạt.
Phương pháp nhân giống cà phê bằng cách tạo phơi vơ tính trong ống nghiệm được thực hiện như sau:
Lá cà phê từ các cây nuơi cấy in vitro được cắt thành các mảnh cĩ kích thước 1cm2, khơng chứa gân chính. Đặt những mẫu lá này lên trên mơi trường MS, vitamin Morel, 30g/l saccharose, 10% nước dừa, 10mg/l BA ,0,1mg/l IBA và 40 mg/l adenine.
Sau 50 – 60 ngày ở mép cắt xung quanh các mảnh lá xuất hiện các đốm trắng hình cầu nhỏ li ti. Các lát cắt của các khối cầu này với 200-300 tế bào nhìn dưới kính hiển vi cĩ thể thấy rõ chúng gồm các tế bào đặc trưng cho phơi (tế bào chất đậm đặc, khơng cĩ khơng bào,nhân to).
Các phơi hình cầu cĩ kích thước từ 1 – 2 mm được cấy vào mơi trường nhân phơi với 5mg/l BA, 0,1mg/l IBA và 40ng/l adenine.
Nếu nhân phơi trên mơi trường rắn với 8g/l aga, số lượng phơi tăng lên khoảng 2,5 lần sau một tháng nuơi cấy.
Nếu nhân phơi trong mơi trường lỏng trên máy lắc 50 vịng/phút số lượng phơi tăng 7 – 8 lần sau một tháng nuơi cấy.
Các phơi phát triển rễ và lá sị sẽ được cấy chuyền sang mơi trường nhân giống khơng cĩ chất sinh trưởng. Sau 50 – 60 ngày, khi cây cĩ 5 – 6 cặp lá cĩ thể đưa ra vườn ươm.
Do sự phát triển của phơi vơ tính giống hệt như phơi hữu tính nên đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu tạo hạt nhân tạo từ phơi vơ tính. Thành tựu của cơng nghệ này sẽ cung cấp cho sản xuất nơng nghiệp một số lượng hạt giống thuần chủng vơ cùng to lớn trong một thời gian ngắn, đồng thời sẽ cho phép nhà nơng gieo thẳng hạt trong vườn ươm hay trên đồng ruộng, giảm nhẹ được chi phí nhân giống trong ống nghiệm và chi phí vận chuyển. Cho đến nay một số cơng ty đa quốc gia đã đưa thành cơng hạt nhân tạo của một số giống rau lai ra thị trường.
Đối với cây cà phê, các nhà khoa học tại Trung tâm Cơng nghệ sinh học TP. Hồ Chí Minh đã thành cơng bước đầu trong việc tạo hạt nhân tạo từ phơi vơ tính của cà phê lai Arabusta bằng cách bọc phơi bằng alginate trong dung dịch CaCl2.2H2O. Một tính chất quý giá của alginate là dễ dàng tạo gen. Tuy nhiên vì gel alginate cĩ tính ưa nước nên sau khi dùng nĩ làm vỏ bọc thì cần phải bọc tiếp bên ngồi một lớp vỏ kỵ nườc để hạt dễ bảo quản. Lớp kỵ nước này được phủ bằng chitosan vốn cũng cĩ tính tương hợp sinh học như alginate. Với điện tích dương của mình, chitosan khi được sử dụng làm lớp vỏ ngồi sẽ làm cho vỏ bọc mềm khi cĩ mặt của nước. Tính bền vững của lớp vỏ bọc cĩ thể được tăng cường bằng cách trung hịa số điện tích dương dư thừa của chitosan.