Callus được tạo ra trên mẫu cấy in vitro để đáp lại tác dụng của các chất tạo vết thương và các chất kích thích sinh trưởng nội sinh hoặc được bổ sung vào mơi trường. Các mẫu cấy từ hầu như tất cả các cấu trúc hoặc bộ phận của thực vật: cành, rễ, lá, các cơ quan dự trữ hoặc quả đều được sử dụng để tạo callus. Cấy
chuyền liên tục với khoảng cách ba hoặc bốn tuần từ các đám tế bào nhỏ lấy từ khối callus này cĩ thể duy trì callus trong thời gian dài.
Mơi trường nuơi cấy phổ biến là mơi trường MS chứa một tổ hợp cân bằng các hợp chất vơ cơ được pha bổ sung với mơi trường Linsmaier và Skoog cĩ thành phần hữu cơ cân đối. Cả hai mơi trường này đều giàu nguyên tố đa lượng, đặc biệt là nitơ, bao gồm các ion nitrate NO3- và ion ammon NH4+, saccharose và các vitamin. Để bắt đầu phân chia tế bào và tạo callus tiếp theo địi hỏi phải cung cấp cytokinin và auxin cho mơi trường với tỉ lệ thích hợp. Auxin với nồng độ trung bình và cao là yếu tố sinh trưởng đầu tiên được sử dụng để tạo callus. Các auxin chủ yếu được sử dụng là IAA, NAA và 2,4-D theo trật tự tăng dần tính hiệu quả. Cytokinin (như kinetin hoặc benzyladenine) được cung cấp với nồng độ thấp hơn nếu chúng cĩ quá ít trong mẫu cấy.
Mặc dù khối callus cĩ bề ngồi như một khối tế bào đồng nhất, nhưng trên thực tế cấu trúc của chúng tương đối phức tạp về các bản chất hình thái, sinh lý và di truyền. Sinh trưởng của chúng tuân thủ đường cong logarit điển hình:
- Tốc độ phân chia tế bào ban đầu rất chậm, địi hỏi phải cĩ auxin;
- Phase phân chia tế bào rất nhanh cùng với sinh tổng hợp nhanh chĩng ADN, ARN và protein;
- Tiếp theo là sự ngừng từ từ tốc độ phân chia tế bào ;
- Cuối cùng là phase phân hĩa thành các nhĩm tế bào nhu mơ và tế bào mơ dẫn.
Phân chia tế bào khơng xảy ra với tồn bộ khối tế bào nuơi cấy mà chỉ xảy ra ban đầu ở khối tế bào sinh trưởng nằm tại lớp tế bào mặt ngồi. Bộ phận bên trong của callus vẫn duy trì trạng thái khơng phân chia và duy trì đặc điểm sinh lý, di truyền khác với khối tế bào mặt ngồi. Tốc độ phân chia của lớp tế bào bên ngồi giảm xuống và trên khối callus xuất hiện các u nhỏ do sự phân chia tế bào bị hạn chế ở những khu vực tế bào nhất định. Như vậy, sự biến động về tuổi và kiểu tế bào cĩ thể xảy ra bên trong khối callus nuơi cấy. Các tế bào bên trong già hơn, các tế bào bên ngồi trẻ hơn và vẫn duy trì khả năng sinh trưởng.
Sự tái sinh cây con từ callus phụ thuộc nhiều vào tỉ lệ cytokinin/auxin bổ sung vào mơi trường nuơi cấy. Nếu tỉ lệ này cao sẽ tạo chồi là chính, nếu ngược lại rễ sẽ hình thành, nếu tỉ lệ này cân bằng sẽ vừa tạo chồi vừa tạo rễ. Trên cơ sở nguyên tắc chung này cần phải chọn tỉ lệ hai nhĩm phytohormon này thích hợp cho từng loại cây trồng.
Callus cĩ tiềm năng bổ ích đối với các phương pháp nhân giống thương mại do cĩ tốc độ tái sinh cây con cao ở quy mơ cơng nghiệp. Tuy nhiên, trong thực tế các phương pháp này chưa được sử dụng một cách trực tiếp do trong quá trình nhân giống rất thường xảy ra hiện tượng sai lệch di truyền và biến đổi kiểu hình. Vì vậy, kiểu hệ thống nuơi cấy này chủ yếu được sử dụng để tạo ra các genotype mới. Sự
biến đổi tính di truyền xảy ra trong thực vật được tạo ra từ khối tế bào hoặc callus được gọi là sự biến đổi dịng vơ tính (somaclonal variation). Những biến đổi này cĩ thể xảy ra một cách tự nhiên hoặc được tạo ra bằng cách xử lý các tác nhân gây đột biến hoăïc bằng các kỹ thuật cơng nghệ gen đặc biệt.
Tuy nhiên, đối với hàng loạt cây trồng việc nhân giống thơng qua tạo mơ sẹo đem lại kết quả rất tốt. Cĩ thể tìm hiểu kỹ thuật này qua ví dụ đối với cây mía đường.
Lấy phần ngọn mía 3 – 4 tháng tuổi, bĩc bỏ các bẹ già và xử lý vơ trùng mẫu bằng hypochlorit canxi 5% trong 20 phút. Cắt phần lá non thành từng mảnh cĩ kích thước 0,5 x 2 cm và cấy vào mơi trường MS cĩ bổ sung 2,4D. Sau 2 tuần mơ sẹo sẽ hình thành.
Khi đã cĩ mơ sẹo, đem cấy chuyền để mơ sẹo đạt kích thước 15 – 16 mm. Chọn các mơ sẹo khơ và chặt chuyển sang mơi trường MS cĩ bổ sung IBA và BA, đặt dưới ánh sáng huỳnh quang 2000-3000 lux. Sau 1 tuần các điểm xanh xuất hiện và sau 3 – 4 tuần cây mía con hình thành, cao 2 – 3 cm, đẻ nhánh rất mạnh tạo thành cụm chồi.
Khi đã cĩ cụm chồi, cấy chuyền nhiều lần vào mơi trường MS cĩ bổ sung phối hợp giữa BA với IBA hoặc NAA với kinetin. Chồi mía tiếp tục đẻ nhánh mạnh; một số chồi vươn cao thành cây mía con. Tách những cây này cấy sang mơi trường tạo rễ và tiếp tục chia các cụm chồi để cấy chuyền nhiều lần.