VII. NUƠI CẤY VÀ DUNG HỢP PROTOPLAST Ở THỰC VẬT 4 5-
2. Dung hợp protoplast 4 8-
Sự kết hợp hai protoplast làm một được gọi là dung hợp (fusion) hay lai vơ tính. Hiện tượng này được Power và Cocking phát hiện năm 1971 trong các thí nghiệm dung hợp cùng lồi và khác lồi các protoplast tách từ chĩp rễ cây ngơ và cây yến mạch. Từ đĩ tiếp tục cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu thành cơng trong việc dung hợp protoplast của nhiều lồi khác nhau song với tần số thấp.
Năm 1974 Kao và Michaylus đã phát hiện polyethylen glycol (PEG) gây ra sự kết dính dung hợp tốt ở protoplast thực vật và tìm ra được các điều kiện để đạt được tần số dung hợp cao.
Trong những năm gần đây các phịng thí nghiệm hiện đại cịn dùng phương pháp dung hợp bằng điện (electrofusion) để tiến hành dung hợp protoplast ở nhiều loại cây. Người ta dùng một thiết bị xung điện (electroprorator) để làm tăng tầng số dung hợp của protoplast khi cho nĩ đi qua cực của máy xung điện. Bằng phương pháp này đã nhận được các cây lai vơ tính giữa Solanum melongena L. và Solanum torvum Sw., giữa các giống khoai tây nhị bội BF 15 (H1), Aminca (H6) và Cardinal (H3).
Chúng ta sẽ làm quen với phương pháp dung hợp protoplast với dịng thuốc lá bạch tạng SRA và dịng thuốc lá xanh Nicotiana tabacum Nia 63 khơng cĩ hoạt tính nitrat reductase.
Dịng Nicotiana tabacum Nia 63 là một dịng đột biến bị hỏng phần apoenzyme của nitrat reductase nên khơng cĩ khả năng khử nitrat và do đĩ khơng thể hấp thụ nitơ nitrat mà chỉ hấp thụ được nitơ dạng amơn. Về hình thái, dịng Nia 63 chỉ tồn tại ở dạng mơ sẹo, khơng cĩ khả năng tái sinh cây hồn chỉnh.
Phép lai được tiến hành giữa dịng Nia 63 với dịng bạch tạng SRA (bị hỏng cơ chế tổng hợp diệp lục) để tạo cây lai màu khảm xanh cĩ khả năng hấp thụ nitơ nitrat (hình 5).
Quá trình lai được tiến hành như sau:
1/ Nguyên liệu;
- Cây thuốc lá bạch tạng SRA được nuơi trên mơi trường MS cĩ chứa 2mg/l BA, 0,5ml/ NAA, 20g/l saccharose, 8g/l agar, pH = 5,6 trong điều kiện ánh sáng yếu, 15 ngày cấy chuyền một lần.
X Protoplast dịng Nia 63 khơng cĩ hoạt tính
nitratreductase Protoplast dịng bạch tạng SRA khơng cĩ khả năng tạo diệp lục
Cây lai khảm xanh cĩ hoạt tính nitratređuctase
Hình 5. Sơ đồ lai vơ tính giữa hai dịng thuốc lá Nia 63 và SRA
- Lấy 2 g mơ sẹo Nia 63 nuơi trong bình tam giác chứa 50ml mơi trường lỏng khống đa lượng MS với nguồn nitơ là succinat amơn, vi lượng B5, 10mg/l thiamin HCl,0,1mg/l GA3, 0,1mg/l BA, 0,4mg/l 2,4D, 30g/l saccharose, pH = 5,6. Các bình tam giác được lắc liên tục trên máy lắc dưới điều kiện ánh sáng yếu. Khoảng 3-4 ngày cấy chuyền một lần.
2/ Hĩa chất.
a/ Enzyme dùng để tạo protoplast.
- Dung dịch enzyme 1: Cellulase Onozuka R10 2%, Maceroenzyme 1% pha trong saccharose 0,4M, pH = 5,6 dùng để tạo protoplast từ lá cây thuốc lá bạch tạng SRA;
- Dung dịch enzyme 2: Callulase Onozuka R10 2%, Macerozyme 1%, Driselase 1% pha trong saccharose 0,4M, pH = 5,6 dùng để tạo protoplast từ dịng Nia 63. Các dung dịch enzyme được lọc vơ trùng qua lọc milipore.
b/ Các hố chất dùng cho dung hợp:
- Dung dịch 1: 0,5M glucose,, 3,5mM CaCl2.2H2O, 0,7mM KH2PO4.H2O trong 1000ml nước cất. pH = 5,6.
- Dung dịch 2: 50mM glycine,50mM CaCl2.2H2O, 0,3 M glucose trong 1000 ml nước cất, pH = 10,5 (chỉnh bằng NaOH 0,1N).
- PEG: Chuẩn bị PEG 40%: 8g PEG (MW 1500 – 6000), 2,5mg KH2PO4.H2O, 31mg CaCl2.2H2O, 1,2 g glucose pha nước cất thành 20ml. Chỉnh pH tới 5,6.
3/ Phương pháp dung hợp.
- Tạo protoplast từ lá cây thuốc lá bạch tạng SRA: lấy 1g lá bạch tạng, cắt nhỏ và ngâm vào 10ml dung dịch enzyme 1, ủ trong tối 12 giờ ở nhiệt độ thường.
- Tạo protoplast từ tế bào nuơi cấy dịch lỏng dịng Nia 63. Lọc dịnh huyền phù tế bào qua phễu lọc sắt 3 ngăn 2000µ, 500µ37µ để loại bỏ các tế bào to. Ly tâm dịch lỏng chứa tế bào ở tốc độ 500 vịng/phút trong 5 phút để thu nhận tế bào, sau đĩ xử lý dung dịch enzyme 2. Ủ 12 giờ trong tối ở nhiệt độ thường.
Dịch enzyme chứa protoplast được lọc và ly tâm 3 lần với saccharose 0,4M để rửa sạch enzyme, sau đĩ ly tâm với dung dịch 1 để làm lắng protoplast.
- Dung hợp:
Trộn hai loại protoplast với nhau theo tỷ lệ 1:1 trong dung dịch 1 với mật độ 5.106/ml. Nhỏ 3 giọt dịch hỗn hợp protoplast lên 3 chỗ trong đĩa Petri nhựa (đường kính 6cm), để yên 15 phút cho protoplast lắng xuống đáy đĩa.
Nhỏ nhẹ nhàng 1 giọt PEG lên đỉnh mỗi giọt dịch chứa protoplast sao cho lớp protoplast dính chặt vào đáy đĩa và khơng bị bong lên.
Ủ protoplast trong dịch PEG 30 phút ở nhiệt độ trong phịng.
Thêm một cách nhẹ nhàng 2 lần cách nhau 15 phút, mỗi lần 0,5 ml dung dịch 2 để làm tăng khả năng kết dính của protoplast. Sau đĩ rửa sạch protoplast 5 lần, mỗi lần 2ml mơi trường nuơi cấy bằng cách dùng pipet Pasteur hút nhẹ dịch rửa ra. Sau khi đã rửa sạch PEG, cho vào mỗi đĩa 2ml mơi trường nuơi cấy cĩ chứa đạm amon để cho tế bào phục hồi sau quá trình tách và dung hợp (nếu cho ngay vào mơi trường chỉ cĩ đạm nitrat vào mơi trường thì cả tế bào dịng Nia 63 vốn khơng cĩ khả năng khử nitrat và tế bào lai đều sẽ chết).
Sau 3 – 4 ngày tế bào bắt đầu phân chia. Cấy chuyền sang mơi trường K1a chỉ cĩ đạm nitrat. Trên mơi trường đạm nitrat các tế bào dịng Nia 63 sẽ chết dần.
Sau 10 ngày nuơi cấy các tế bào phân chia thành cụm tế bào. Cấy chuyền sang mơi trường K2a (giống mơi trường K1a nhưng đường giảm xuống 100g/l, 2,4D 0,1mg/l, BA 0,2mg/l và NAA 0,2mg/l. Sau 10 – 15 ngày quan sát thấy hình thành cụm tế bào to. Cấy chuyền sang mơi trường tạo mơ sẹo (MS chỉ cĩ đạm nitrat, IAA 1mg/l, kinetin 0,5mg/l, thạch 8g/l saccharose 30g/l.
Sau 15 ngày cấy chuyền, để các bình mơ sẹo dưới ánh sáng 2000 lux. Cĩ hai loại tế bào mơ sẹo: một loại mơ màu xanh nhạt, một loại màu trắng vàng. Tiếp tục cấy chuyền 3 – 4 lần trên mơi trường đạm nitrat thì các mơ xanh dịng Nia 63 bị chết, trong khi đĩ các mơ màu trắng vàng phát triển rất mạnh.
Cấy chuyền các mơ sẹo trắng vàng trên mơi trường tạo chồi chứa BA 2mg/l/ IAA 0,5mg/l, đặt dưới ánh sáng 2000 lux. Sau 15 ngày chồi xuất hiện. Giữa những chồi hồn tồn trắng thấy xuất hiện nhiều chồi màu vàng lá khảm xanh (chiếm tỉ lệ ¼ chồi trắng).
Chọn các chồi cĩ lá khảm xanh cấy trên mơi trường khơng cĩ chất sinh trưởng để cho cây ra rễ.
Việc lai vơ tính thành cơng bằng kỹ thuật dung hợp protoplast sẽ mở đường cho việc ứng dụng kỹ thuật này trong tạo giống cây trồng.