VII. NUƠI CẤY VÀ DUNG HỢP PROTOPLAST Ở THỰC VẬT 4 5-
1. Tách và nuơi cấy protoplast thực vật 4 6-
Cĩ thể tách protoplast từ tất cả các phần của cây như rễ, thân, lá, nốt sần rễ, lá mầm, vỏ quả, tràng hoa, tế bào mẹ hạt phấn, từ mơ sẹo hay huyền phù tế bào. Ở đây chúng ta chỉ làm quen với phương pháp tách protoplast từ lá vì các tế bào này tương đối đồng nhất và cĩ ưu điểm là khơng tích lũy các rối loạn di truyền như tế bào mơ sẹo.
Qúa trình tách protoplast gồm 4 bước:
- Khử trùng mẫu (đối với các cây nuơi trồng trong điều kiện vơ trùng thì khơng cần);
- Cắt mẫu; - Xử lý enzyme;
- Làm sạch protoplast và đưa vào mơi trường nuơi cấy.
a/ Tách và nuơi cấy protoplast từ cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) .
• Nguyên liệu:
Cây thuốc lá được nuơi in vitro trên mơi trường MS chứa vitamin Morel,20g/l saccharose, 8g/l agar. Chọn những lá phát triển đầy đủ của những cây 20 – 30 ngày tuổi (5 – 6 lá).
• Xử lý enzyme.
Hỗn hợp enzyme cellulase Onozuka R10 1% và Macerozym 0,5% được pha trong mơi trường Kao đã được cải tiến cĩ chứa sacchrose 0,4M (137g/l), pH 5,8. Dịch enzyme được lọc vơ trùng qua lọc milipore. (Cĩ thể thay thế hỗn hợp enzyme trên bằng Driselase 1%).
Lá thuốc lá được cắt thành sợi nhỏ và ngâm vào hỗn hợp enzyme trong 12 giờ, để trong tối, nhiệt độ 28 – 30oC. Cứ 1g lá tươi cần 10ml hỗn hợp enzyme. Sau khi xử lý lắc nhẹ để các protoplast rời khỏi lá. Tất cả các thao tác thực hiện trong điều kiện vơ trùng. Sau đĩ dịch enzyme chứa protoplast được lọc qua bộ lưới lọc để loại bỏ các mảnh mơ lá. Dịch lọc được ly tâm 500 vịng/phút trong 5 phút. Sau khi ly tâm protoplast nổi lên trên bề mặt một lớp màu xanh; dùng pipet Pasteur hút nhẹ lớp protoplast và chuyển sang một ống nghiệm ly tâm khác cĩ chứa mơi trường Kao. Ly tâm lại hai lần nữa rồi hút lớp protoplast để chuyển sang mơi trường nuơi cấy.
• Nuơi protoplast.
4ml huyền phù protoplast được nuơi trong đĩa Petri φ 60 với mơi trường K1 cải tiến cĩ chứa 0,1mg/l 2,4D, 0,2mg/l BA và 1mg/l NAA sao cho đảm bảo mật độ protoplast đạt 2000/ml mơi trường. Bao paraphin và đặt trong tối trong hộp giữ ẩm.
Sau 4-5 ngày vỏ cellulose hình thành lại và protoplast bắt đầu phân chia. Sau 10 ngày hình thành cụm cĩ từ 4-10 tế bào. Thêm vào mỗi đĩa Petri 2ml mơi trường
K2 (nồng độ NAA giảm xuống 0,2mg/l, đường giảm xuống 100g/l). Sau đĩ hút 1,5ml dịch tế bào gieo trên mặt đĩa thạch chứa mơi trường K3 (K2 cĩ thêm thạch 7g/l).
Sau 5 ngày quan sát bằng kính hiển vi trên mặt thạch hình thành các cụm tế bào lớn. Cắt lớp thạch đĩ thành từng miếng0,5 x 0,5 cm đặt trên mơi trường tạo mơ sẹo (Mơi trường MS chứa 1mg/l 2,4D, 0,5mg/l kinetin), nuơi trên đĩa Petri đặt trong tối.
• Tạo chồi và tái sinh cây.
Sau 15 ngày cấy chuyền, trên mặt thạch hình thành các cụm mơ sẹo lớn màu trắng. Cấy chuyền sang mơi trường tạo chồi (mơi trường khống MS, vitamin Kao, 50mg/l đường, 7g/l thạch,2mg/l BA, 0,5mg/l IAA). Các bình chồi được chiếu sáng 2.000 lux. 8 giớ/ngày. Sau 10 ngày đám mơ sẹo chuyển thành màu xanh hồn tồn và xuất hiện chồi sau 15 ngày. Sau đĩ chuyển sang mơi trường tạo rễ (khống MS, đường 20g/l). Rễ hình thành sau 10 ngày.
b/ Tách protoplast từ mơ thịt lá khoai lang (Ipomoea batatas)
• Nguyên liệu:
Tế bào đơn lá khoai lang được tách bằng cách nghiền mơ lá trong cối Potter. Do lá khoai lang cĩ các tế bào mơ dậu vách khá dày và cĩ độ bền cao đối với tác động cơ giới, việc tạo huyền phù tế bào đơn từ mơ lá khơng cĩ gì khĩ khăn. Các tế bào đơn này được nuơi trên mơi trường Lin và Staba với nồng độ BA 0,1mg/l, 2,4D 0,1mg/l, saccharose 100g/l. Chọn những tế bào đang phân chia lần thứ nhất để tách protoplast.
• Tách và nuơi protoplast.
Cho vào mỗi đĩa Petri cĩ tế bào đơn nuơi trên mặt thạch 3ml hỗn hợp enzyme đã lọc qua milipore gồm cellulase Onozuka R10 2%, pectinase hoặc maceroenzyme 1%, manitol 0,6M, pH 5,8. Dùng que cấy gạt nhẹ tế bào ra khỏi mặt thach và chuyển tồn bộ dịch enzyme chứa tế bào sang đĩa Petri khác, để trong tối ở nhiệt độ 28oC trong thời gian 24 giờ, thỉnh thoảng lắc nhẹ.
Sau khi xử lý enzyme rĩt tất cả dịch enzyme chứa protoplast vào ống nghiệm ly tâm 1 x 12 cm, ly tâm 400 vịng/phút cho protoplast lắng xuống đáy. Dùng pipet hút bỏ dịch enzyme, sau đĩ rửa protoplast bằng cách ly tâm một lần với manitol 0,6M và một lần với mơi trường nuơi cấy. Protoplast được treo trong mơi trường lỏng với mật độ 3.105 protoplast trong 1ml. Lấy 0,5ml protoplast nuơi trên mặt thạch trong đĩa Petri chứa 2ml mơi trường LS cĩ 20g/l saccharose và manitol 0,6M. Gắn parafin giữ ẩm và đặt trong tối ở 28oC.
Trên mơi trường LS sau 10 ngày nuơi cấy phần lớn protoplast sống khỏe mạnh và cĩ thay đổi hình dạng, chứng tỏ tế bào đã hình thành và bắt đầu phân chia. Việc kết hợp phương pháp cơ học để tách tế bào đơn và xử lý enzyme cho phép thu nhận một số lượng lớn protoplast khỏe mạnh.
• Nguyên liệu.
Ngâm hạt lúa 2 – 3 ngày cho nẩy mầm, sau đĩ gieo vào chậu đất. Chọn những cây mạ 13 – 20 ngày tuổi làm nguyên liệu.
• Tách và nuơi protoplast.
Cây lúa được rửa sạch, cắt bỏ rễ và phiến lá. Lấy đoạn bẹ lá dài 5 – 6 cm khử trùng cồn 70o trong 2 phút, sau đĩ bằng hypochlorit canxi 7% trong 20 phút. Rửa nhiều lần bằng nước cất vơ trùng.
Sau khi khử trùng bĩc lấy phần bẹ non màu trắng hay vàng nhạt bên trong, cắt ngang thành từng mảnh nhỏ và ngâm vào hỗn hợp enzyme gồm cellulase Onozuka R10 1% và pectinase 0,5%, manitol 0,6M, pH 5,8 trong 12 giờ ở nhiệt độ 28-30oC, tỉ lệ 1 gam lá tươi trong 10ml dung dịch enzyme. Trong khi ủ thỉnh thoảng lắc nhẹ. loại bỏ các mảnh lá khơng bị enzyme phân hủy, dịch lỏng được rĩt vào ống ly tâm đáy nhọn, ly tâm 500 vịng/phút trong 5 phút để protoplast nổi lên. Dùng pipet hút và cho vào mơi trường nuơi cấy ở mật độ 104 – 105/ml. Các đĩa Petri được gắn parafin và đặt vào chỗ tối ở nhiệt độ 25oC.