1.6.1. Các nghiên cứu ngoài nước
Trên thế giới, công nghệ sản xuất ethanol sinh học đã được nghiên cứu và ứng dụng thành công ở nhiều quốc gia, trong đó có Việt Nam. Tuy nhiên, nguyên liệu phục vụ cho công nghệ sản xuất ethanol sinh học chủ yếu từ các cây lương thực, rơm rạ[11][18][1] còn từ nguồn rong biển chưa được nghiên cứu và ứng dụng nhiều. Đối với Việt Nam vấn đề này vẫn còn rất mới mẻ và đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học.
Rong biển là sinh vật tự dưỡng nhờ quá trình quang hợp mà sinh trưởng, phát triển nên sản lượng rong biển trên thế giới rất dồi dào. Theo số liệu của tổ chức FAO, năm 2006 thống kê, nguồn rong biển tự nhiên ở các vùng biển trên thế giới rất lớn, có thể sử dụng nguồn này để sản xuất ethanol sinh học thay thế cho các nguồn lương thực khác, như Trung Quốc sản lượng
rong tươi hằng năm là 323 nghìn tấn/năm, Chile là 305 nghìn tấn/năm, NaUy là 145 nghìn tấn/năm, Nhật Bản là 113 nghìn tấn/năm, Pháp là 75 nghìn tấn/năm và Ireland là 29 nghìn tấn/năm. Ngoài ra, tổ chức FAO cũng thống kê các nước trồng rong lớn nhất thế giới thuộc vào các nước Châu Á, như Trung Quốc là 10,800 nghìn tấn/năm, Philippin là 1,300 nghìn tấn/năm, Indonesia là 900 nghìn tấn/năm và những nước khác là 2,000 nghìn tấn/năm.[14]
Những nguyên liệu có thể dùng để sản xuất ethanol là đường, tinh bột và nguyên liệu chứa cellulose ( Bailey and Ollis, 1986). Đường có thể biến đổi trực tiếp thành ethanol nhưng tinh bột phải được thủy phân thành đường dưới tác dụng của enzyme rồi mới lên men thành ethanol, còn cellulose cũng phải biến đổi thành đường trước khi lên men bằng acid vô cơ (Bashir and Lee, 1994). Sở dĩ có thể dùng rong biển để sản xuất ethanol vì nhiều loài rong biển có chứa hàm lượng cacbohydrat cao, có thể dùng để chuyển hóa lên men rượu. Đã có nhiều tài liệu nước ngoài công bố về vấn đề này như rong Nâu
Laminaria ở vùng biển Ireland được đất nước này khai thác để sản xuất ethanol sinh học có chứa 6% cellulose, 23% alginates, 12% mannitol, fucoidan 5%, laminaran 14%, proteins 2%, lipid 2%, không thấy hàm lượng tinh bột, hemicellulose và lignin. Khác với rong Nâu, rong lục có hàm lượng ẩm cao hơn rất nhiều, chiếm đến 85%, hàm khoáng 24%, protein 19%, lipid 2%, cellulose 18%, ulvan 20%, tinh bột 2%, hợp chất sunfat 8% và chất màu nhỏ hơn 1% [10][14].
Alginate là một polysaccharide trong rong Nâu không thể lên men nhờ những vi sinh vật truyền thống, mà muốn lên men được phải qua xử lý ở nhiệt độ cao trước khi lên men hoặc dùng những vi sinh vật lên men thích ứng. Ở NaUy, Horn và cộng sự năm 2004 đã tìm ra chủng nấm men P. angophorae
để lên men rong Nâu nhưng hiệu suất lên men không cao, còn các nhà nghiên cứu của trường đại học quốc gia Ireland (NUIG) đã tách được một enzyme từ
nấm kỵ khí Talaromyces emersonii được xem là cắt đứt rất tốt các hợp chất đường phức tạp để tạo ra đường đơn giản [14].
Năm 2007, nhóm tác giả Aizawa, M; Asaoka, K; Atsumi, M; Sakou, T của trường Đại học Tokai Nhật Bản đã công bố kết quả nghiên cứu về sản xuất ethanol sinh học của Nhật Bản do Tokyo Fisheries Promotion Foundation đầu tư trên tạp chí Oceans 2007. Dự án sản xuất ethanol từ rong biển Sargassum hornerilà một loại rong Nâu, có hàm lượng cacbohydrate 5.8%, kết quả thu được 29,6 kg ethanol hoặc 38.0 lít ethanol trên 1 tấn rong tươi có độ ẩm 90%.[9]
Năm 2009, nhóm tác giả DuBok Choi, Heung Sun Sim, Yu Lan Piao, Wu Ying và Hoon Cho của hai trường Đại học Cho-dang và Chusun Hàn Quốc đã công bố kết quả nghiên cứu về sản xuất đường từ nguyên liệu rong biển thô trên tờ báo Industrial and Engineering Chemistry. Kết quả công bố, rong biển thô được cắt nhỏ 5cm, sau đó bổ sung HCl, Ascorbic acid và NaOH từ 0,25 ÷ 2%, hỗn hợp được gia nhiệt ở 1210C; 0,98 bar, trong thời gian 1-3h, tác giả so sánh hiệu quả thủy phân giữa các mẫu bằng cách so sánh độ nhớt giữa các hỗn hợp sau khi kết thúc thủy phân, trường hợp rong biển thủy phân trong Ascorbic acid cho thấy độ nhớt giảm một cách nhanh chóng, tiếp đến là mẫu xử lý HCl và cuối cùng mẫu xử lý NaOH. Nhóm tác giả cũng công bố cho biết khi rong biển thủy phân bằng hỗn hợp enzyme Liquozyme, Dextrozyme, Viscozyme và Rapidase trong điều kiện nhiệt độ 300C, thời gian 360 phút thì hàm lượng đường sinh ra nhiều hơn so với dùng Ascorbic acid [13].
Năm 2010 nhóm tác giả Churl Kim, Hyun Jin Ryu, Sang Hyoun Kim, Jeong – Jun Yoon, Hoon Sik Kim và Yong Jin Kim của trường đại học Kyung Hee đã công bố kết quả nghiên cứu trên tạp chí Bull. Korean Chem.Soc về sử dụng chất lỏng ion để chuyển hóa agar thành hỗn hợp đường. Phản ứng đường hóa agar được tiến hành như sau: Một hỗn hợp 10g agar được trích ly từ Gelidium amansii cho vào hỗn hợp nước chứa chất lỏng ion có tính chất
acid ([Chol][HSO4]). Phản ứng thủy phân được thực hiện ở 121 C trong 15 phút, sau đó điều chỉnh hỗn hợp pH về 5.5 bằng cách bổ sung CaCO3 và chất lỏng ion được tách ra bằng cách ly tâm [11].
Năm 2011, nhóm tác giả Kazunori Nakashima và cộng sự của trường Đại học Kobe Nhật Bản đã công bố kết quả nghiên cứu về sản xuất bioethanol từ cellulose bằng cách kết hợp giữa nấm men có chứa enzyme cellulase với tiền xử lý chất lỏng ion (ionic liquid) trên trang Green Chemistry. Kết quả công bố, khi cellulose được tiền xử lý với các chất lỏng ion như [Emim][Cl]; [Emim][OAc]; [Emim][DEP] ở điều kiện 800C, thời gian 30 phút; sau đó hỗn hợp được trung hòa bằng dung dịch đệm acetat, điều chỉnh pH về 5.0, hỗn hợp tiếp tục bổ sung 5ml hỗn hợp nấm men endoglucanase (EG), cellobiohydrolase (CBH), và β-glucosidase (BGL), đồng thời bổ sung nấm men 5ml S.cerevisiae tiến hành lên men ở nhiệt độ 300C, thời gian 96h thì hiệu suất thu ethanol lên đến 90% và có thể tái sử dụng các chất lỏng ion đến 82% [16].
NaUy đã nghiên cứu sản xuất ethanol từ hai loài rong Nâu là Laminaria hyperborea và Ascophyllum nodosum thành công, họ đã chiết laminaran và mannitol từ rong Nâu Laminaria hyperborea để sản xuất ethanol (Horn, et al.,
2000)[15][18]. Hàm lượng mannitol và laminaran trong rong Nâu khô khoảng 25 ÷ 30% (Jensen and Haug, 1956). Quá trình lên men ethanol từ mannitol nhờ vi khuẩn Zymobacter palmae, còn vi khuẩn Pichia angophorae có thể tham gia sản xuất ethanol cả hai nguồn mannitol và laminaran. Những vi sinh vật phổ biến được sử dụng để lên men ethanol là Saccharomyces cerevisiae
và vi khuẩn Zymomonas mobilis (Dumsday et al, 1997) [14].
Năm 2011 nhóm tác giả Krish Purnawan Candra, Sarwono, Sarinah của trường Đại học Mulawarman Indonesia đã công bố kết quả nghiên cứu trên tạp chí Journal of Coastal Development về sản xuất ethanol sinh học từ rong đỏ Eucheuma cottonii trên vùng biển Baotang của Indonesia theo quy trình sau: Rong sau khi thu hoạch được phơi khô và bảo quản trong các túi nilon, đưa về phòng thí nghiệm được bảo quản ở nhiệt độ phòng, 100g rong khô cho vào 300ml nước, sau đó đun sôi ở nhiệt độ 800C trong 2giờ cho đến khi gel được hình thành, sau đó làm nguội xuống nhiệt độ phòng. 25 ml H2SO4 5% rót vào một lọ thủy tinh chứa 100g gel rong biển đem đun sôi ở 1000C trong 2 giờ, sau đó dung dịch được điều chỉnh về pH = 5 bằng cách nhỏ 0,1M NaOH, hàm lượng đường xác định là 15.8mg/ml dịch thủy phân bằng phương pháp Nelson Somogyi. Hỗn hợp được lên men từ 5-6 ngày ở nhiệt độ phòng từ 28-300C bằng nấm men Saccharomyces cereviceae thì thu được sản lượng cồn tối đa là 4,6% [15].
Năm 2011 nhóm tác giả Leilei Ge, Peng Wang, Haijin Mou của trường College of Food Science and Engineering và Ocean University của Trung Quốc đã công bố kết quả nghiên cứu trên tạp chí Renewable Energy về nghiên cứu công nghệ đường hóa bã rong để chuyển hóa ethanol. Nguyên liệu dùng nghiên cứu là phần bã thừa của quá trình sản xuất alginate được xay nhỏ và sấy khô ở 400C, sau đó bảo quản ở nhiệt độ phòng. Bã rong được tiền xử lý bằng acid sulfuric loãng lần lượt là 0,1; 0,2; 0,5 và 1% trong thời gian 0,5; 1,0 và 1,5 giờ tại nhiệt độ 1210C. Sau đó, phần bã không tan được lọc tách ra và rửa với
nước nóng. Hỗn hợp được điều chỉnh về pH = 4.8 bằng dung dịch đệm acetat, tiếp tục bổ sung enzyme cellulase và cellobiase để thủy phân cellulose, hemicellulose và lignin không tan ở nhiệt độ 500C trong 48h. Sau đó hỗn hợp được lên men bằng Saccharomyces cerevisiae ở nhiệt độ 300C trong 36h, lượng ethanol thu được là 41,2%, tương ứng với hiệu suất là 80,8% [17].
Năm 2011 nhóm tác giả Mitsunori Yanagisawa, Kanami Nakamura, Osamu Ariga, Kiyohiko Nakasaki của Viện công nghệ Tokyo và trường đại học công nghệ Kochi Nhật Bản đã công bố kết quả nghiên cứu các loài rong có chứa polysaccharides có thể thủy phân một cách dễ dàng dùng để sản xuất rượu sinh học trên tạp chí Process Biochemistry. Nhóm tác giả đã nghiên cứu trên 3 đối tượng rong: rong lục Ulva pertusa Kjellman, rong Nâu Alaria crasssifolia và rong đỏ Gelidium elegans Kuetzing, đối với rong lục và rong Nâu sau khi thu hoạch về được phơi nắng trong 5h để dùng làm thí nghiệm, còn rong đỏ được sấy ở 600C trong 2 ngày. Tất cả các loại rong đều xay nhỏ đến 0.5mm. Tổng hàm lượng cacbohydrat trong 3 loại rong này được xác định bằng tổng của NFE (nitrogen –free extrac) và phần sợi thô được xác định bằng phương pháp chuẩn dùng phân tích thực phẩm lần lượt là 68,8; 61,0 và 83,2%, hàm lượng glucan trong các loại rong này lần lượt là 22,0; 24,5 và 21,8% trọng lượng rong khô tuyệt đối. Hàm lượng galactan chỉ có trong rong đỏ với hàm lượng 26,5% trọng lượng rong khô tuyệt đối. Đây là những polysaccharide chứa các đường có thể lên men một cách dễ dàng[22].
Như vậy, kết quả nghiên cứu của nhiều nhóm tác giả đã công bố cho thấy, sản xuất ethanol sinh học từ rong biển có thể sử dụng nhiều phương pháp tiền xử lý rong để tạo dung dịch đường như tiền xử lý bằng acid H2SO4[17][25], HCl[13], acid ascorbic[13], xút (NaOH)[13], enzyme[17][22] hoặc kết hợp giữa các phương pháp với nhau[17]. Còn sử dụng bằng chất lỏng ion kết hợp với phương pháp dùng enzyme hoặc acid hiệu quả đối với nguyên liệu chứa nhiều cellulose như phụ phẩm nông nghiệp[11]. Hàm lượng
cellulose trong rong biển không cao [10][14][3]trong khi chất lỏng ion lại đắt nên việc sử dụng chất lỏng ion để tiền xử lý rong biển không hiệu quả, chỉ hiệu quả đối với các phế liệu nông nghiệp như rơm, rạ, mùn cưa,..
1.6.2. Các nghiên cứu trong nước
Nghiên cứu về sản lượng rong biển tại Việt Nam và Khánh Hòa: Hiện nay tại Việt Nam chưa có bất kỳ tác giả nào công bố kết quả nghiên cứu về sản xuất ethanol sinh học từ rong biển mà chỉ dừng nghiên cứu khảo sát sản lượng rong biển phục vụ sản xuất ethanol và nghiên cứu một số thành phần hóa học của một số loại rong có tại Việt Nam, trong đó có hàm lượng polysaccharide, như tác giả Lê Như Hậu và cộng sự của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang với đề tài “ Nghiên cứu và đề xuất giải pháp khai thác hợp lý và bền vững cho rong nguyên liệu sản xuất ethanol ở ven biển Nha Trang” năm 2010 đã công bố, trữ lượng các ngành rong biển tại Nha Trang như sau: Khu vực vịnh Nha Trang có diện tích rong Mơ 546,20ha. Rong Mơ phát triển thành thảm với sinh lượng trung bình đạt 571,90g.khô/m2, trữ lượng 4840,4 tấn khô/năm. Rong Đỏ là 231,97 tấn khô/năm và rong lục là 16,53 tấn khô/năm[2]. Tác giả cũng công bố kết quả nghiên cứu trong báo cáo hội nghị khoa học nhân dịp kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam diễn ra tại Hà Nội vào tháng 10 năm 2010 là Rong biển Việt Nam gồm những chi có sản lượng lớn Sargassum, Hormophysa,
Hydroclathrus (rong Nâu); Gracilaria, Hydropuntia, Hypnea, Kappaphycus
(Rong Đỏ); Ulva, Chaetomorpha, Cladophora (Rong Lục),hiện nay có thể khai thác 79.126,3 tấn rong khô trên diện tích 75.322,0 ha. Diện tích mặt nước có tiềm năng nuôi trồng và khai thác rong biển trong thời kỳ 2010-2015 khoảng 900.000 ha với sản lượng 600-700.000 tấn khô/năm. Như vậy, rong biển Việt Nam, cũng như rong biển tại các vùng biển Khánh Hòa có trữ lượng rất lớn, có khả năng đáp ứng nguồn nguyên liệu cho công nghệ sản xuất ethanol sinh học ở quy mô công nghiệp bằng khai thác nguồn nguyên liệu tự
nhiên và nuôi trồng bằng mô hình kết hợp hoặc luân canh trong các ao nuôi tôm và ở các bãi triều ven biển, đặc biệt vùng ven biển Nha Trang các nhóm rong có trữ lượng lớn là rong đỏ, rong lục và rong mơ.
Nghiên cứu về hàm lượng cacbonhyrat trong rong biển:
Monosaccharide quan trọng trong rong Nâu là đường mannitol được Stenhouds phát hiện ra năm 1884 và được Kylin (1913) chứng minh thêm. Hàm lượng mannitol trong rong Nâu dao động từ 14-25% trọng lượng rong khô tùy thuộc vào hoàn cảnh địa lý và nơi sinh sống. Theo kết quả nghiên cứu của Viện Hải Dương học Nha Trang năm 1979, xác định sự biến động hàm lượng mannitol trên 2 đối tượng rong Nâu S.mcclurie và S.kjellmanianum tại vùng biển Hòn Chồng, Nha Trang lần lượt là 15,79 – 16,36 (từ tháng 3 đến tháng 5); 12,40-13,82 (từ tháng 3 đến tháng 4). Còn kết quả nghiên cứu của Trần Thị Luyến, Nguyễn Anh Tuấn, Trường Đại học Nha Trang, xác định hàm lượng mannitol vào tháng 4 trong rong Nâu S.mcclurie ở vùng biển Quảng Nam-Đà Nẵng, Bình Định, Khánh Hòa, Ninh Thuận lần lượt là 15,6; 11,3; 15,4 và 14,8. Nếu rong bảo quản không tốt, độ ẩm cao làm cho mannitol bị phá hủy. Hàm lượng mannitol trong rong Nâu ở vùng biển Khánh Hòa được phân tích có hàm lượng trung bình vào khoảng 6,3 – 11,35% trọng lượng rong khô tuyệt đối. Trong đó, loài S.mcclurei có hàm lượng cao hơn cả. Tháng 4 và 5 là lúc rong Nâu đã trưởng thành, có kích thước lớn nhất, hàm lượng acid alginic và mannitol cao nhất [5].
Polysaccharide trong rong Nâu chủ yếu là alginic, hàm lượng alginic dao động từ 13-15% trọng lượng rong khô. Hàm lượng này phụ thuộc vào loài rong và vị trí địa lý môi trường rong sinh sống. Theo các tài liệu tổng kết của Miyake (1995) cho thấy hàm lượng alginic trong các loài rong Nâu ở các vùng biển Liên Xô cũ dao động từ 13-40%. Theo tài liệu phân tích các chuyên gia Bộ Thủy sản cho thấy hàm lượng alginic trong các loại rong Nâu ở Hải Phòng dao động từ 22-40%. Theo số liệu nghiên cứu của Viện Hải Dương
học năm 1979, hàm lượng alginic trong rong S.mcclurie và S.kjellmanianum ở vùng biển miền trung Việt Nam dao động từ 39,24 – 44,40% so với rong khô tuyệt đối từ tháng 3 đến tháng 5. Còn kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Trường Đại học Nha Trang năm 1998 - 2000, hàm lượng alginic trong rong
S.mcclurie và S.kjellmanianum ở vùng biển miền trung Việt Nam trong tháng 4 dao động từ 35,9 đến 39,4% so với trọng lượng rong khô tuyệt đối [5].
Như vậy, từ các tài liệu đã công bố tại Việt Nam và thế giới cho thấy, sản lượng rong biển rất dồi dào với giá thành thấp, trong rong biển chứa một hàm lượng cacbohydrat cao nên việc sử dụng rong biển để sản xuất ethanol sinh học là khả thi.
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu rong Nâu
Rong nâu: Sargassum mcclure (S.mcclure), Sargassum polycystum (S.polycystum), Sargassum microcystum (S.microcystum), Sargassum binderi (S.binderi). Rong nâu sử dụng trong nghiên cứu được khai thác từ tháng 4 đến tháng 6 năm 2011, tại vùng biển Nha Trang. Rong Nâu được mua tại các đầu nậu từ Nha Trang. Sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm dùng dần. Rong sau khi đem về được xử lí để loại các tạp chất cũng như các loại rong tạp, được chứa trong các túi polypropylene (PP), bảo quản ở nơi khô ráo thoáng mát. Một lần thí nghiệm sẽ lấy một ít đem đi cắt và xay nhỏ. Yêu cầu rong