Nghiên cứu về sản lượng rong biển tại Việt Nam và Khánh Hòa: Hiện nay tại Việt Nam chưa có bất kỳ tác giả nào công bố kết quả nghiên cứu về sản xuất ethanol sinh học từ rong biển mà chỉ dừng nghiên cứu khảo sát sản lượng rong biển phục vụ sản xuất ethanol và nghiên cứu một số thành phần hóa học của một số loại rong có tại Việt Nam, trong đó có hàm lượng polysaccharide, như tác giả Lê Như Hậu và cộng sự của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang với đề tài “ Nghiên cứu và đề xuất giải pháp khai thác hợp lý và bền vững cho rong nguyên liệu sản xuất ethanol ở ven biển Nha Trang” năm 2010 đã công bố, trữ lượng các ngành rong biển tại Nha Trang như sau: Khu vực vịnh Nha Trang có diện tích rong Mơ 546,20ha. Rong Mơ phát triển thành thảm với sinh lượng trung bình đạt 571,90g.khô/m2, trữ lượng 4840,4 tấn khô/năm. Rong Đỏ là 231,97 tấn khô/năm và rong lục là 16,53 tấn khô/năm[2]. Tác giả cũng công bố kết quả nghiên cứu trong báo cáo hội nghị khoa học nhân dịp kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam diễn ra tại Hà Nội vào tháng 10 năm 2010 là Rong biển Việt Nam gồm những chi có sản lượng lớn Sargassum, Hormophysa,
Hydroclathrus (rong Nâu); Gracilaria, Hydropuntia, Hypnea, Kappaphycus
(Rong Đỏ); Ulva, Chaetomorpha, Cladophora (Rong Lục),hiện nay có thể khai thác 79.126,3 tấn rong khô trên diện tích 75.322,0 ha. Diện tích mặt nước có tiềm năng nuôi trồng và khai thác rong biển trong thời kỳ 2010-2015 khoảng 900.000 ha với sản lượng 600-700.000 tấn khô/năm. Như vậy, rong biển Việt Nam, cũng như rong biển tại các vùng biển Khánh Hòa có trữ lượng rất lớn, có khả năng đáp ứng nguồn nguyên liệu cho công nghệ sản xuất ethanol sinh học ở quy mô công nghiệp bằng khai thác nguồn nguyên liệu tự
nhiên và nuôi trồng bằng mô hình kết hợp hoặc luân canh trong các ao nuôi tôm và ở các bãi triều ven biển, đặc biệt vùng ven biển Nha Trang các nhóm rong có trữ lượng lớn là rong đỏ, rong lục và rong mơ.
Nghiên cứu về hàm lượng cacbonhyrat trong rong biển:
Monosaccharide quan trọng trong rong Nâu là đường mannitol được Stenhouds phát hiện ra năm 1884 và được Kylin (1913) chứng minh thêm. Hàm lượng mannitol trong rong Nâu dao động từ 14-25% trọng lượng rong khô tùy thuộc vào hoàn cảnh địa lý và nơi sinh sống. Theo kết quả nghiên cứu của Viện Hải Dương học Nha Trang năm 1979, xác định sự biến động hàm lượng mannitol trên 2 đối tượng rong Nâu S.mcclurie và S.kjellmanianum tại vùng biển Hòn Chồng, Nha Trang lần lượt là 15,79 – 16,36 (từ tháng 3 đến tháng 5); 12,40-13,82 (từ tháng 3 đến tháng 4). Còn kết quả nghiên cứu của Trần Thị Luyến, Nguyễn Anh Tuấn, Trường Đại học Nha Trang, xác định hàm lượng mannitol vào tháng 4 trong rong Nâu S.mcclurie ở vùng biển Quảng Nam-Đà Nẵng, Bình Định, Khánh Hòa, Ninh Thuận lần lượt là 15,6; 11,3; 15,4 và 14,8. Nếu rong bảo quản không tốt, độ ẩm cao làm cho mannitol bị phá hủy. Hàm lượng mannitol trong rong Nâu ở vùng biển Khánh Hòa được phân tích có hàm lượng trung bình vào khoảng 6,3 – 11,35% trọng lượng rong khô tuyệt đối. Trong đó, loài S.mcclurei có hàm lượng cao hơn cả. Tháng 4 và 5 là lúc rong Nâu đã trưởng thành, có kích thước lớn nhất, hàm lượng acid alginic và mannitol cao nhất [5].
Polysaccharide trong rong Nâu chủ yếu là alginic, hàm lượng alginic dao động từ 13-15% trọng lượng rong khô. Hàm lượng này phụ thuộc vào loài rong và vị trí địa lý môi trường rong sinh sống. Theo các tài liệu tổng kết của Miyake (1995) cho thấy hàm lượng alginic trong các loài rong Nâu ở các vùng biển Liên Xô cũ dao động từ 13-40%. Theo tài liệu phân tích các chuyên gia Bộ Thủy sản cho thấy hàm lượng alginic trong các loại rong Nâu ở Hải Phòng dao động từ 22-40%. Theo số liệu nghiên cứu của Viện Hải Dương
học năm 1979, hàm lượng alginic trong rong S.mcclurie và S.kjellmanianum ở vùng biển miền trung Việt Nam dao động từ 39,24 – 44,40% so với rong khô tuyệt đối từ tháng 3 đến tháng 5. Còn kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Trường Đại học Nha Trang năm 1998 - 2000, hàm lượng alginic trong rong
S.mcclurie và S.kjellmanianum ở vùng biển miền trung Việt Nam trong tháng 4 dao động từ 35,9 đến 39,4% so với trọng lượng rong khô tuyệt đối [5].
Như vậy, từ các tài liệu đã công bố tại Việt Nam và thế giới cho thấy, sản lượng rong biển rất dồi dào với giá thành thấp, trong rong biển chứa một hàm lượng cacbohydrat cao nên việc sử dụng rong biển để sản xuất ethanol sinh học là khả thi.
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu rong Nâu
Rong nâu: Sargassum mcclure (S.mcclure), Sargassum polycystum (S.polycystum), Sargassum microcystum (S.microcystum), Sargassum binderi (S.binderi). Rong nâu sử dụng trong nghiên cứu được khai thác từ tháng 4 đến tháng 6 năm 2011, tại vùng biển Nha Trang. Rong Nâu được mua tại các đầu nậu từ Nha Trang. Sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm dùng dần. Rong sau khi đem về được xử lí để loại các tạp chất cũng như các loại rong tạp, được chứa trong các túi polypropylene (PP), bảo quản ở nơi khô ráo thoáng mát. Một lần thí nghiệm sẽ lấy một ít đem đi cắt và xay nhỏ. Yêu cầu rong không được có hiện tượng ẩm mốc trên bề mặt rong.
Hình 2.1. Bốn loài rong nâu sử dụng để nghiên cứu.
S.microcystum S. binderi
2.1.2. Nấm men
Nấm men được dùng để lên men ethanol là loài nấm men
Saccharomyces cerevisiae do hãng Novozym – Đan Mạch cung cấp. Điều kiện hoạt động:
Nhiệt độ hoạt động: 25 – 30 0C
pH hoạt động: 4.5 – 5.5
Nhiệt độ bảo quản lạnh: 8 – 12 0C
Hình 2.2. Nấm men Saccharomyces cerevisiae.
2.1.3. Enzyme viscozyme
Enzyme dùng để thủy phân cacbonhydrat trong rong Nâu là enzyme viscozyme được mua tại phòng vi sinh, viện sinh học nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh. Thuộc hãng Novozym - Đan Mạch. Chế phẩm viscozyme (L) là enzyme thu được từ chủng nấm mốc Aspergillus aculeatus, có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 25 – 55oC, pH hoạt động tối ưu ở pH 3,7 – 6 có tác dụng làm giảm độ nhớt dễ lọc trong lắng nhanh. Enzyme ở dạng lỏng, màu nâu, được đựng trong lọ nhỏ và bảo quản lạnh ở nhiệt độ 8 – 12 0C.
Hình 2.3. Sản phẩm Enzyme viscoenzyme. 2.1.4. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
2.1.4.1. Hóa chất
Các hóa chất được sử dụng đều có xuất xứ Trung Quốc, đảm bảo các chỉ tiêu chất lượng về hóa chất sử dụng trong thí nghiệm thực hành.
Bảng 2.1. Các dụng cụ được sử dụng trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp.
Một số chỉ tiêu chất lượng Hóa chất Trạng thái, tính chất Độ tinh khiết (>= %) Cl (<= %) SO4 (<= %) Fe (<= %) As (<= %) Acid sunfuric Chất lỏng sánh không màu CTPT: H2SO4 M= 98.08 95 - 98 0.0003 - 0.00005 0.000003 Acid ascorbic Chất rắn khang màu trắng CTPT: CHO M=
Sắt (III) sunfat Chất rắn khang màu trắng Fe2(SO4)3 Thành phần không hòa tan (<= 0.001%) 0.0002 0.1 0.01 0.0005 KaliNatr iTatrat Tinh thể màu trắng C4H4O6KNa. .4H2O M= 282.22 99 0.001 0.005 - - Xút Chất rắn khang màu trắng CTPT: NaOH M= 40 96 0.005 0.005 - - Acid acetic Chất lỏng sánh không màu CH3COOH 99.5 0.001 0.0002 0.001 - Natri acetat Tinh thể màu trắng CH3COONa pH= 7.5-9.0 99 0.002 - - - Đồng Sunfat Tinh thể màu xanh dương CuSO4.5H2O M= 249.68 99 0.001 - 0.003 -
Ngoài ra còn một số hóa chất như KMnO4 0,1 N, chì acetat, NaSO4, phenolphthalein 1% trong cồn 900
Feling A: CuSO4 tinh thể 69,28g cho nước cất vừa đủ 1000ml lắc cho tan.
Feling B: Kalinatritartrat 346g, NaOH 100g, nước cất vừa đủ 1000ml.
Dung dịch sắt (III) sunfat: Fe2(SO4)3 50g, H2SO4 đậm đặc 200g, nước cất cho đủ 1000ml.
2.1.4.2. Dụng cụ
Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu đề tài:
Bảng 2.2. Một số hóa chất sử dụng trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp.
STT Tên dụng cụ
1 Bình tam giác (250 ml, 500 ml, 1000 ml)
2 Bình định mức (100 ml, 1000 ml)
3 Cốc đong (100 ml, 500 ml)
4 Đũa thủy tinh
5 Ống bóp cao su 6 Pipet 7 Buret 8 Một số các dụng cụ cần thiết khác trong các phòng thí nghiệm thực hành
2.1.4.3. Máy móc và thiết bị
Bảng 2.3. Máy móc và thiết bị sử dụng trong đề tài.
STT Tên thiết bị Thông số Hãng sản
xuất 1 NỒI CÁCH THỦY ĐIỀU NHIỆT WNB10+LO
Khoảng nhiệt độ: (nhiệt độ môi trường +5) ... 950C
- Độ phân giải nhiệt độ: +/- 0,10C - Độ đồng nhất nhiệt độ: +/- 0,250C Sony, Nhật 2 CÂN KỸ THUẬT ĐIỆN TỬ BL 320 H - Độ chính xác 0,001g ; - Độ lặp lại : 0,001 g - Độ tuyến tính : 0,003 g
- Đường kính của đĩa cân : 100 x 100 mm
SHIMAZ U
Nhật bản
3
MÁY CÔ QUAY CHÂN KHÔNG RV10
- Khoảng tốc độ quay: 20 - 270 vòng/phút, hiển thị số tốc độ quay.
- Khoảng nhiệt độ của bếp gia nhiệt từ nhiệt độ môi trường đến 180 0C với sai số là +/- 1
0C
- Điều kiện môi trường làm việc: nhiệt độ: 5 – 40 0C, độ ẩm: 80% IKA Đức 4 MÁY ĐO pH ĐỂ BÀN - Khoảng đo pH: -1 – 15 pH - Độ phân giải pH: 0.01 pH - Độ chính xác: +/- 0.01pH (250) :+/- 0.04pH (00C…. 500C) Windaus 5 BỂ LÀM LẠNH TUẦN HOÀN VS – 1902 WF - Thể tích sử dụng : 14 lít - Độ chính xác nhiệt độ : +/- 0,1 0C tại 37 0C VISION Hàn quốc
6
NỒI HẤP TIỆT TRÙNG LOẠI
110LÍT
- Thời gian tiệt trùng: 1 đến 250phút có thể cài đặt
- Khoảng nhiệt độ tiệt trùng: 105 đến 135 0C - Đồng hồ đo áp: 0 tới 0.4Mpa Hãng sản xuất: Hira yama-Nhật Bản
2.2. Nội dung nghiên cứu
Xác định hàm lượng cacbonhydrat trong rong nâu Sargassum polycystum
Xác lập các điều kiện thủy phân tối ưu bằng acid sunfuric kết hợp với viscozyme.
Xác lập các điều kiện lên men ethanol tối ưu từ dịch thủy phân.
Chưng cất thu nhận ethanol từ dịch lên men.
2.3. Phương pháp nghiên cứu và xử lí số liệu 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.1. Phương pháp phân tích
- Xác định hàm lượng cacbohydrate trong rong biển khô theo: Cacbohydrate% = 100% – (hàm lượng tro + protein thô + chất béo thô).
- Xác định hàm lượng đường khử trong dịch thủy phân bằng phương pháp Bertrand.
- Phân tích hàm lượng tro theo (AOAC 938.08)
Nguyên tắc chung : Tro hoá mẫu bằng nhiệt. Sau đó xác định hàm lượng tro bằng phương pháp khối lượng và xác định độ kiềm của tro bằng phương pháp chuẩn độ.
- Phân tích độ ẩm theo TCVN 3700-90
Nguyên tắc chung : Dùng nhiệt để loại bỏ nước khỏi mẫu thử. Hiệu số khối lượng của mẫu thử trước và sau khi sấy khô là lượng ẩm có trong mẫu.
- Phân tích hàm lượng chất béo thô theo TCVN 3703-2009Nguyên tắc chung : Dùng dung môi hữu cơ chiết rút mỡ của mẫu thử trong máy soclet. Sấy và cân lượng mỡ đã được chiết rút.
- Phân tích hàm lượng protein thô theo TCVN 3705-90
Nguyên tắc chung : Vô cơ hóa mẫu thử bằng axit sunfuric đậm đặc, nitơ có trong mẫu thử chuyển thành amon sunfat. Dùng kiềm đặc đẩy amoniac ra khỏi amon sunfat trong máy cất đạm, tạo thành amon hydroxyt, rồi định lượng bằng axit.
- Phương pháp xác định hàm lượng ethanol theo TCVN 5562:2009.
2.3.1.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
- Bố trí thí nghiệm xác định các thông số tối ưu cho quá trình thủy phân cacbonhydrat trong Sargassum polycystum.
- Bố trí thí nghiệm xác định các thông số tối ưu cho quá trình lên men ethanol bằng dịch đường từ Sargassum polycystum.
2.3.2. Phương pháp xử lí số liệu
Xử lí nghiên cứu theo phương pháp thống kê, mỗi thí nghiệm làm 3 lần. Kết quả là trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm, xử lí số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel 2007, SPSS 1.60.
2.4. Xây dựng quy trình nghiên cứu dự kiến
2.4.1. Quy trình dự kiến thủy phân cacbonhydrat trong rong Nâu
Sargassum polycystum 2.4.1.1. Quy trình dự kiến
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình dự kiến quá trình thủy phân cacbonhydrat trong rong Nâu.
2.4.1.2. Thuyết minh quy trình
Nguyên liệu rong Nâu
Rong Nâu sau khi thu nhận vẩn chuyển về phòng thí nghiệm, nếu không sử dụng ngay phải bảo quản rong Nâu trong điều kiện tốt nhất để tránh
t0 thủy phân Nồng độ acid t (phút) thủy phân Rong Nâu Bổ sung nước Xử lí, xay nhỏ Trung hòa Thủy phân 1 Dung dịch monosaccharide Lọc
Vô hoạt enzyme Thủy phân 2
Kiểm tra hàm lượng đường
t0 thủy phân
Nồng độ enzyme
Thời gian thủy phân pH môi trường
ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm sau này. Chất lượng nguyên liệu ban đầu là yếu tố ảnh hưởng lớn đến chất lượng ethanol sau này.
Xử lí và xay nhỏ
Xử lí nhằm mục đích loại những tạp chất khô không mong muốn trong nguyên liệu. Dùng tay để phân loại, loại những loài rong tạp, cát, sạn, san hô và tạp chất còn bán trên rong.
Cắt và xay nhỏ nhằm mục đích phá vỡ một phần cấu trúc của tế bào, tăng diện tích tiếp xúc giữa acid và cơ chất. Tạo điều kiện cho quá trình thủy phân diễn ra với hiệu suất cao nhất. Dùng kéo và máy xay khô để thực hiện.
Bổ sung nước
Nước là nhân tố không thể thiếu cho qúa trình thủy phân. Nước tạo môi trường thuận lợi để phản ứng thủy phân diễn ra nhanh chóng và đạt hiệu suất cao nhất. Nước dùng để thí nghiệm là nước cất một lần.
Thủy phân 1
Đây là quá trình chuyển các polysaccharide của rong Nâu thành các monosaccharide hòa tan.
Thủy phân cacbonhydrat trong rong nâu bằng acid H2SO4 2% ở nhiệt độ 1200C, thời gian 120 phút.
Trung hòa
Trung hòa lượng acid đem đi thủy phân 1, tạo điều kiện thuận lợi cho viscozyme hoạt động sau này.
Thủy phân 2
Thủy phân cacbonhydrat trong rong nâu bằng ezyme viscozyme với nồng độ từ 0.5% - 7% so với nước, đem đi thủy phân ở nhiệt độ 45 0C – 600C, trong thời gian từ 40 – 55h, pH môi trường 4 – 6.
Vô hoạt enzyme
Mục đích là đình chỉ hoạt đông của enzyme viscozyme bằng cách cho mẫu đã thủy phân vào nước đang đun sôi, giữ nhiệt cho nước sôi trong 10 phút.
Lọc và kiểm tra hàm lượng đường khử
Lọc bỏ cặn rong Nâu đã thủy phân xong, tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định các chỉ tiêu hóa học và các công đoạn tiếp theo. Lấy dịch thủy phân đem đi kiểm tra hàm lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand.
2.4.2. Quy trình dự kiến lên men dịch đường tạo ethanol sinh học
2.4.2.1. Quy trình dự kiến
Hình 2.5. Quy trình dự kiến sản xuất ethanol.
Dịch thủy phân cacbonhydrat
Trung hòa dịch
Điều chỉnh pH
Bổ sung nấm men
Lên men ethanol
Chưng cất
Thu nhận ethanol
Kiểm tra lượng đường còn lại
pH môi trường Tỷ lệ nấm men
t0 lên men Thời gian lên men
2.4.2.2.Thuyết minh quy trình
Dịch thủy phân cacbonhydrat trong rong Nâu
Sau khi thủy phân carbonhydat trong rong Nâu ta thu được dịch đường, dịch này đem đi làm mẫu cho các thí nghiệm nghiên cứu các thông số tối ưu cho quá trình lên men ethanol tiếp theo
Trung hòa dịch đường
Công đoạn này nhằm mục đích trung hòa lượng acid đem đi thủy phân, để tạo môi trường thuận lợi cho nấm men hoạt động sau này.
Tiến hành cho vài giọt chỉ thị phennolphatalenin 1% trong cồn 900, sau đó dùng NaOH 20% và 1% chuẩn đến khi dịch đường đổi màu, dùng giấy đo pH để kiểm tra pH dịch đường.
Lên men ethanol
Mục đích của công đoạn này là chuyển hóa các loại đường đơn có trong dịch thủy phân rong Nâu thành ethanol sinh học.
Tiến hành lên men với pH môi trường, tỷ lệ nấm men và thời gian lên men thích hợp. Lên men ở nhiệt độ phòng.
Chưng cất
Sau khi lên men ethanol kết thúc, tiến hành chưng cất để thu lượng ethanol tạo thành.
Sử dụng thiết bị Cô quay Chân không ở nhiệt độ 500C để chưng cất đuổi ethanol ra khỏi dịch lên men, thu nhận ethanol .
Thu nhận ethanol
Dịch ethanol thu được sau chưng cất được bảo quản trong các lọ thủy