2.3.1. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.1. Phương pháp phân tích
- Xác định hàm lượng cacbohydrate trong rong biển khô theo: Cacbohydrate% = 100% – (hàm lượng tro + protein thô + chất béo thô).
- Xác định hàm lượng đường khử trong dịch thủy phân bằng phương pháp Bertrand.
- Phân tích hàm lượng tro theo (AOAC 938.08)
Nguyên tắc chung : Tro hoá mẫu bằng nhiệt. Sau đó xác định hàm lượng tro bằng phương pháp khối lượng và xác định độ kiềm của tro bằng phương pháp chuẩn độ.
- Phân tích độ ẩm theo TCVN 3700-90
Nguyên tắc chung : Dùng nhiệt để loại bỏ nước khỏi mẫu thử. Hiệu số khối lượng của mẫu thử trước và sau khi sấy khô là lượng ẩm có trong mẫu.
- Phân tích hàm lượng chất béo thô theo TCVN 3703-2009Nguyên tắc chung : Dùng dung môi hữu cơ chiết rút mỡ của mẫu thử trong máy soclet. Sấy và cân lượng mỡ đã được chiết rút.
- Phân tích hàm lượng protein thô theo TCVN 3705-90
Nguyên tắc chung : Vô cơ hóa mẫu thử bằng axit sunfuric đậm đặc, nitơ có trong mẫu thử chuyển thành amon sunfat. Dùng kiềm đặc đẩy amoniac ra khỏi amon sunfat trong máy cất đạm, tạo thành amon hydroxyt, rồi định lượng bằng axit.
- Phương pháp xác định hàm lượng ethanol theo TCVN 5562:2009.
2.3.1.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
- Bố trí thí nghiệm xác định các thông số tối ưu cho quá trình thủy phân cacbonhydrat trong Sargassum polycystum.
- Bố trí thí nghiệm xác định các thông số tối ưu cho quá trình lên men ethanol bằng dịch đường từ Sargassum polycystum.
2.3.2. Phương pháp xử lí số liệu
Xử lí nghiên cứu theo phương pháp thống kê, mỗi thí nghiệm làm 3 lần. Kết quả là trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm, xử lí số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel 2007, SPSS 1.60.
2.4. Xây dựng quy trình nghiên cứu dự kiến
2.4.1. Quy trình dự kiến thủy phân cacbonhydrat trong rong Nâu
Sargassum polycystum 2.4.1.1. Quy trình dự kiến
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình dự kiến quá trình thủy phân cacbonhydrat trong rong Nâu.
2.4.1.2. Thuyết minh quy trình
Nguyên liệu rong Nâu
Rong Nâu sau khi thu nhận vẩn chuyển về phòng thí nghiệm, nếu không sử dụng ngay phải bảo quản rong Nâu trong điều kiện tốt nhất để tránh
t0 thủy phân Nồng độ acid t (phút) thủy phân Rong Nâu Bổ sung nước Xử lí, xay nhỏ Trung hòa Thủy phân 1 Dung dịch monosaccharide Lọc
Vô hoạt enzyme Thủy phân 2
Kiểm tra hàm lượng đường
t0 thủy phân
Nồng độ enzyme
Thời gian thủy phân pH môi trường
ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm sau này. Chất lượng nguyên liệu ban đầu là yếu tố ảnh hưởng lớn đến chất lượng ethanol sau này.
Xử lí và xay nhỏ
Xử lí nhằm mục đích loại những tạp chất khô không mong muốn trong nguyên liệu. Dùng tay để phân loại, loại những loài rong tạp, cát, sạn, san hô và tạp chất còn bán trên rong.
Cắt và xay nhỏ nhằm mục đích phá vỡ một phần cấu trúc của tế bào, tăng diện tích tiếp xúc giữa acid và cơ chất. Tạo điều kiện cho quá trình thủy phân diễn ra với hiệu suất cao nhất. Dùng kéo và máy xay khô để thực hiện.
Bổ sung nước
Nước là nhân tố không thể thiếu cho qúa trình thủy phân. Nước tạo môi trường thuận lợi để phản ứng thủy phân diễn ra nhanh chóng và đạt hiệu suất cao nhất. Nước dùng để thí nghiệm là nước cất một lần.
Thủy phân 1
Đây là quá trình chuyển các polysaccharide của rong Nâu thành các monosaccharide hòa tan.
Thủy phân cacbonhydrat trong rong nâu bằng acid H2SO4 2% ở nhiệt độ 1200C, thời gian 120 phút.
Trung hòa
Trung hòa lượng acid đem đi thủy phân 1, tạo điều kiện thuận lợi cho viscozyme hoạt động sau này.
Thủy phân 2
Thủy phân cacbonhydrat trong rong nâu bằng ezyme viscozyme với nồng độ từ 0.5% - 7% so với nước, đem đi thủy phân ở nhiệt độ 45 0C – 600C, trong thời gian từ 40 – 55h, pH môi trường 4 – 6.
Vô hoạt enzyme
Mục đích là đình chỉ hoạt đông của enzyme viscozyme bằng cách cho mẫu đã thủy phân vào nước đang đun sôi, giữ nhiệt cho nước sôi trong 10 phút.
Lọc và kiểm tra hàm lượng đường khử
Lọc bỏ cặn rong Nâu đã thủy phân xong, tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định các chỉ tiêu hóa học và các công đoạn tiếp theo. Lấy dịch thủy phân đem đi kiểm tra hàm lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand.
2.4.2. Quy trình dự kiến lên men dịch đường tạo ethanol sinh học
2.4.2.1. Quy trình dự kiến
Hình 2.5. Quy trình dự kiến sản xuất ethanol.
Dịch thủy phân cacbonhydrat
Trung hòa dịch
Điều chỉnh pH
Bổ sung nấm men
Lên men ethanol
Chưng cất
Thu nhận ethanol
Kiểm tra lượng đường còn lại
pH môi trường Tỷ lệ nấm men
t0 lên men Thời gian lên men
2.4.2.2.Thuyết minh quy trình
Dịch thủy phân cacbonhydrat trong rong Nâu
Sau khi thủy phân carbonhydat trong rong Nâu ta thu được dịch đường, dịch này đem đi làm mẫu cho các thí nghiệm nghiên cứu các thông số tối ưu cho quá trình lên men ethanol tiếp theo
Trung hòa dịch đường
Công đoạn này nhằm mục đích trung hòa lượng acid đem đi thủy phân, để tạo môi trường thuận lợi cho nấm men hoạt động sau này.
Tiến hành cho vài giọt chỉ thị phennolphatalenin 1% trong cồn 900, sau đó dùng NaOH 20% và 1% chuẩn đến khi dịch đường đổi màu, dùng giấy đo pH để kiểm tra pH dịch đường.
Lên men ethanol
Mục đích của công đoạn này là chuyển hóa các loại đường đơn có trong dịch thủy phân rong Nâu thành ethanol sinh học.
Tiến hành lên men với pH môi trường, tỷ lệ nấm men và thời gian lên men thích hợp. Lên men ở nhiệt độ phòng.
Chưng cất
Sau khi lên men ethanol kết thúc, tiến hành chưng cất để thu lượng ethanol tạo thành.
Sử dụng thiết bị Cô quay Chân không ở nhiệt độ 500C để chưng cất đuổi ethanol ra khỏi dịch lên men, thu nhận ethanol .
Thu nhận ethanol
Dịch ethanol thu được sau chưng cất được bảo quản trong các lọ thủy tinh có nắp đậy kín. Phải được cất chứa trong khu vực thông gió tốt, tránh xa ánh sáng mặt trời, các nguồn gây cháy và các nguồn nhiệt khác.
Kiểm tra hàm lượng đường còn lại bằng phương pháp Bertrand
Dịch sau khi chưng cất thu nhận ethanol xong được đem đi kiểm tra lại hàm lượng đường khử còn lại sau lên men.
2.5. Bố trí thí nghiệm
2.5.1. Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ enzyme thủy phân thích hợp
2.5.1.1. Mục đích
Xác định được nồng độ enzyme viscozyme bổ sung vào dịch thủy phân nâng cao hiệu quả thủy phân cacbonhydrat trong rong Nâu đạt hiệu quả và tiết kiệm kinh phí nhất.
2.5.1.2. Cách tiến hành
Chuẩn bị 8 mẫu thí nghiệm.
Thủy phân ở các điều kiện: - Khối lượng mẫu: 5g - Nước cất bổ sung: 100ml - Nhiệt độ thủy phân: 50 0C - Thời gian thủy phân: 50h - pH môi trường : 5
Rong Nâu đã được phơi khô, đem xử lí và xay nhỏ, chuẩn bị 8 mẫu, mỗi mẫu cân 5g rong Nâu đã xay cho vào bình đình mức, thêm vào 100ml nước cất. Sau đó điều chỉnh pH của môi trường bằng 5 bằng cách cho vào 10ml dung dịch đệm CH3COOH/CH3COONa có pH bằng 5. Tiếp theo bổ sung enzyme viscoezyme theo tỷ lệ so với 100ml nước lần lượt là 0%, 1%, 2%, 3%. 4%, 5%, 6%, 7%. Sau đó đậy kín nắp và đem đi thủy phân ở nhiệt độ 50 0C trong thời gian 50h. Lấy mẫu ra đem đi vô hoạt enzyme bằng cách cho mẫu thủy phân vào nước đang đun sôi, giữ ở nhiệt độ sôi trong 10 phút. Lọc, đem dịch lọc đi kiểm tra hàm lượng đường khử. Chọn nồng độ thích hợp nhất cho quá trình thủy phân cacbonhydrat trong rong Nâu.
2.5.1.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ enzyme viscozyme thủy phân cacbonhydrat trong rong Nâu thích hợp.
Chọn nồng độ enzyme thích hợp
Bã
0% 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7%
Thủy phân cacbonhydrat Vô hoạt enzyme,Lọc
Kiểm tra hàm lượng đường bằng Bertrand Rong Nâu Xay nhỏ Bổ sung nước Điều chỉnh pH Bổ sung viscozyme
2.5.2. Thí nghiệm 2: Xác định pH môi trường thủy phân thích hợp
2.5.2.1. Mục đích
Xác định được pH môi trường thủy phân thích hợp nâng cao hiệu quả thủy phân cacbonhydrat trong rong Nâu và tiết kiệm kinh phí nhất.
2.5.2.2. Cách tiến hành
Chuẩn bị 5 mẫu thí nghiệm.
Thủy phân ở các điều kiện: - Khối lượng mẫu: 5g - Nước cất bổ sung: 100ml
- Nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân (Kết quả TN 1) - Nhiệt độ thủy phân: 50 0C
- Thời gian thủy phân: 50h
Rong Nâu đã được phơi khô, đem xay nhỏ, Chuẩn bị 5 mẫu, mỗi mẫu cân 5g rong Nâu đã xay cho vào bình định mức , thêm vào 100ml nước cất. Sau đó điều chỉnh pH của môi trường lần lượt bằng 4.0, 4.5, 5.0, 5.5 bằng cách cho vào 10ml dung dịch đệm CH3COOH/CH3COONa có pH lần lượt là 4.0, 4.5, 5.0, 5.5. Tiếp theo bổ sung enzyme viscozyme với nồng độ thích hợp cho quá trình thủy phân cacbonhydrat (KQTN 1). Sau đó đậy kín nắp và đem đi thủy phân ở nhiệt độ 50 0C trong thời gian 50h. Lấy mẫu ra đem đi vô hoạt enzyme bằng cách cho mẫu thủy phân vào nước đang đun sôi, giữ ở nhiệt độ sôi trong 10 phút. Rồi lọc, đem dịch lọc đi kiểm tra hàm lượng đường khử. Chọn pH môi trường thích hợp nhất cho quá trình thủy phân carbonhydat trong rong Nâu.
2.5.2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH môi trường thủy phân thích hợp.
4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
Rong Nâu
Xay nhỏ
Bổ sung nước
Điều chỉnh pH
Bổ sung enzyme viscozyme
Lựa chọn pH môi trường thích hợp
Bã
Thủy phân ở nhiệt độ 50 0C, thời gian 50h
Vô hoạt enzyme,Lọc
Kiểm tra hàm lượng đường dịch lọc bằng pp Bettran
2.5.3. Thí nghiệm 3: Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp
2.5.3.1. Mục đích
Xác định được nhiệt độ thủy phân dịch nâng cao hiệu suất thủy phân cacbonhydrat trong rong Nâu và tiết kiệm kinh phí nhất.
2.5.3.2. Cách tiến hành
Chuẩn bị 4 mẫu thí nghiệm.
Thủy phân ở các điều kiện: - Khối lượng mẫu: 5g - Nước cất bổ sung: 100ml
- Nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân (Kết quả TN 1) - pH môi trường thích hợp cho quá trình thủy phân (Kết quả TN 2) - Thời gian thủy phân: 50h
Rong Nâu đã được phơi khô, đem xay nhỏ, Chuẩn bị 4 mẫu, mỗi mẫu cân 5g rong Nâu đã xay cho vào bình đình mức , thêm vào 100ml nước cất. Sau đó điều chỉnh pH môi trường thích hợp cho quá trình thủy phân (KQTN 2) bằng cách cho vào 10ml dung dịch đệm CH3COOH/CH3COONa . Tiếp theo bổ sung enzyme viscozyme với nồng độ thích hợp cho quá trình thủy phân (KQTN 1). Sau đó đậy kín nắp và đem đi thủy phân ở nhiệt độ lần lượt là 45 0C, 50 0C , 55 0C, 60 0C trong thời gian 50h. Lấy mẫu ra đem đi vô hoạt enzyme bằng cách cho mẫu thủy phân vào nước đang đun sôi, giữ ở nhiệt độ sôi trong 10 phút. Rồi lọc, đem dịch lọc đi kiểm tra hàm lượng đường khử. Chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp nhất cho quá trình thủy phân.
2.5.3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp.
Rong Nâu
Xay nhỏ Bổ sung nước Điều chỉnh pH
Thủy phân với thời gian 50h
45 0C 50 0C 55 0C 60 0C
Chọn nhiệt độ thích hợp
Bã
Vô hoạt enzyme, Lọc
Kiểm tra hàm lượng đường dịch lọc bằng pp Bettran
Bổ sung enzyme viscozyme
2.5.4. Thí nghiệm 4: Xác định thời gian thủy phân thích hợp
2.5.4.1. Mục đích
Xác định được thời gian thủy phân thích hợp nâng cao hiệu suất thủy phân cacbonhydrat rong Nâu và tiết kiệm kinh phí nhất.
2.5.4.2. Cách tiến hành
Chuẩn bị 4 mẫu thí nghiệm.
Thủy phân ở các điều kiện: - Khối lượng mẫu: 5g - Nước cất bổ sung: 100ml
- Nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân (Kết quả TN 1) - pH môi trường thích hợp cho quá trình thủy phân (Kết quả TN 2) - Nhiệt độ thủy phân thích hợp cho quá trình thủy phân (Kết quả TN3) Rong Nâu đã được phơi khô, đem xay nhỏ, Chuẩn bị 5 mẫu, mỗi mẫu cân 5g rong Nâu đã xay cho vào bình đình mức , thêm vào 100ml nước cất. Sau đó điều chỉnh pH môi trường thích hợp cho quá trình thủy phân (KQTN2) bằng cách cho vào 10ml dung dịch đệm CH3COOH/CH3COONa . Tiếp theo bổ sung enzyme viscozyme với nồng độ thích hợp cho quá trình thủy phân (KQTP 1). Sau đó đậy kín nắp và đem đi thủy phân ở nhiệt độ thích hợp ( KQTP 3) trong thời gian lần lượt là 40h, 45h, 50h, 55h. Lấy mẫu ra đem đi vô hoạt enzyme bằng cách cho mẫu thủy phân vào nước đang đun sôi, giữ ở nhiệt độ sôi trong 10 phút. Rồi lọc, đem dịch lọc đi kiểm tra hàm lượng đường khử. Chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp nhất cho quá trình thủy phân.
2.5.4.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp.
Rong Nâu Xay nhỏ Bổ sung nước Điều chỉnh pH Bổ sung enzyme viscozyme Thủy phân 40h 45h 50h 55h
Chọn thời gian thủy phân thích hợp
Bã
Vô hoạt enzyme, Lọc
Kiểm tra hàm lượng đường dịch lọc bằng pp Bettran
2.5.5. Thí nghiệm 5: Thủy phân cacbonhydrat trong rong Nâu bằng cách kết hợp thủy phân rong Nâu bằng acid và enzyme viscozyme
2.5.5.1. Mục đích
Làm tăng hiệu quả thủy phân cacbonhydrat trong rong Nâu
2.5.5.2. Cách tiến hành
Chuẩn bị 8 mẫu thí nghiệm.
Thủy phân ở các điều kiện: - Khối lượng mẫu: 5ml - Nước cất bổ sung: 100ml
- Thời gian thủy phân thích hợp cho quá trình thủy phân (Kết quả TN1) - pH môi trường thích hợp cho quá trình thủy phân (Kết quả TN 2) - Nhiệt độ thủy phân thích hợp cho quá trình thủy phân (Kết quả TN3) Rong Nâu đã được phơi khô, đem xay nhỏ, Chuẩn bị 8 mẫu, mỗi mẫu cân 5g rong Nâu đã xay cho vào bình đình mức, thêm vào 100ml nước cất. Bổ sung 2ml acid H2SO4, đem đi thủy phân ở 120 0C, trong 120h [phụ lục 3.6]. Mẫu thủy phân bằng acid được đem đi trung hòa để loại hết acid còn lại trong mẫu. Sau đó, điều chỉnh pH môi trường về pH thích hợp cho quá trình thủy phân cacbonhydrat trong rong Nâu (KQTN 2) bằng cách sử dụng dung dịch đệm CH3COOH/CH3COONa . Tiếp theo, bổ sung enzyme theo tỷ lệ lần lượt là 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%. Đem đi thủy phân ở nhiệt độ thủy phân thích hợp (KQTN 3), thời gian thủy phân thích hợp cho thủy phân cacbonhydrat trong rong Nâu (KQTN 4). Lấy mẫu ra đem đi vô hoạt enzyme bằng cách cho mẫu thủy phân vào nước đang đun sôi, giữ ở nhiệt độ sôi trong 10 phút. Rồi lọc, đem dịch lọc đi kiểm tra hàm lượng đường khử. Chọn nồng độ enzyme thủy phân kết hợp thích hợp nhất cho quá trình thủy phân.
2.5.5.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm kết hợp thủy phân rong Nâu bằng acid và enzyme viscozyme - Nhiệt độ: 120 0C - Thời gian: 120h - Nồng độ acid: 2% so với nước Rong Nâu Xay nhỏ Bổ sung nước Bổ sung acid H2SO4 Thủy phân lần 1 Trung hòa acid
Điều chỉnh pH môi trường Bổ sung enzyme (%)
Thủy phân lần 2
Lựa nồng độ viscozym thích hợp
Bã Vô hoạt enzyme,
Lọc
Kiểm tra hàm lượng đường dịch lọc bằng pp Bettran
2.5.6. Thí nghiệm 6: Xác định tỷ lệ nấm men sử dụng
2.5.6.1. Mục đích
Xác định được tỷ lệ nấm men Saccharomyces cerevisiae bổ sung vào dịch thủy phân để quá trình lên men diễn ra đạt hiệu quả và tiết kiệm chi phí nhất.
2.5.6.2. Cách tiến hành
Chuẩn bị 6 mẫu thí nghiệm.
Lên men ở cùng điều kiện - Khối lượng mẫu: 5g - pH môi trường: 5
- Nhiệt độ lên men: nhiệt độ phòng - Thời gian lên men: 3 ngày
Cân 5g rong Nâu khô đã được xử lý, xay nhỏ. Cho vào bình tam giác 250ml. Sau đó cho thêm 100ml nước cất, 6 ml dung dịch acid H2SO4 đậm đặc. Tiến hành bọc kín bình, đem thủy phân trong nồi thanh trùng ở nhiệt độ 1200C , trong thời gian 120 phút, sau đó trung hòa, điều chỉnh pH = 4.5, bổ sung 12ml enzyme viscozyme, đem thủy phân ở nhiệt độ 55 0C/ 45h. Tiếp đó