11. ĐỊNH TÍNH FAECAL STREPTOCOCCUS TRONG THỰC PHẨM 1.Nguyên tắc
4.4.2.Ba giai đoạn trong một chu kỳ của phản ứng PCR
Cĩ 3 giai đoạn chính trong phản ứng PCR và chúng được lặp đi lặp lại nhiều lần (chu kỳ) (thường từ 25 đến 75 chu kỳ).
Trong giai đoạn này phân tử DNA mẫu bị biến tính ở nhiệt độ cao (thường là từ 94-95 oC, lớn hơn nhiệt độ nĩng chảy của phân tử) trong vịng 30 giây đến 1 phút, tất cả các liên kết hydro giưã hai mạch của phân tử bị bẻ gãy và tạo thành các DNA sợi đơn.
b. Giai đoạn lai (hybridization)
Nhiệt độ được hạ thấp ( thường từ 40-70oC, thấp hơn nhiệt độ nĩng chảy của mồi được sử dụng khoảng từ 3-5oC) cho phép các mồi bám vào các phân tử DNA sợi đơn, đánh dấu phần DNA cần được khuyếch đại. Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến một phút (cịn được gọi là giai đoạn ủ).
Nếu nhiệt độ quá thấp thì các mồi sẽ gây nên nhiều lỗi và kết quả là sẽ tạo nên nhiều sản phẩm phụ. Nếu nhiệt độ quá cao thì phản ứng sẽ khơng cĩ kết quả.
Cơng thức để xác định nhiệt độ nĩng chảy (Tm) một cách tương đối là: Tm=4(G+C) + 2(A+T)
c. Giai đoạn kéo dài (elongation)
Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt nhất. Cơng việc của DNA polymerase là di chuyển dọc theo DNA sợi đơn và sử dụng nĩ làm khuơn để tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA mẫu bằng cách kéo dài các phần đã được đánh dấu bởi các mồi. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước của DNA mẫu, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Ở giai đoạn này của chu kỳ cuối cùng, thời gian được tăng thêm vài phút để các sợi DNA chưa được sao chép xong hồn thành qúa trình tổng hợp.Sau mỗi chu kỳ, số bản sao của DNA mẫu lại được tăng gấp đơi. Ðây là sự nhân bản theo cấp số nhân. Như vậy 1 phân tử DNA mẫu, sau phản ứng PCR với n chu kỳ tạo thành 2n bản sao phân tử DNA.
Hình 19. Ba giai đoạn của của phản ứng PCR
Chu kỳ ba bước lặp lại nhiều lần, sau 30-40 chu kỳ sẽ tạo ra 106 bản sao. Sau phản ứng PCR, ADN được nhuộm bởi ethidium bromide và được quan sát qua điện di sản phẩm PCR trong gel agarose và quan sát dưới tia UV
Hình 20. Ðồ thị biễu diễn mối quan hệ giữa thời gian và nhiệt độ trong một chu kỳ của phản ứng PCR
Bảng . Số bản sao của phân tử DNA mẫu tạo thành qua các chu kỳ của phản ứng PCR
Chu kỳ Số bản sao 1 2 4 10 15 20 25 30 ... n 21=2 22=4 24=16 210=1.024 215=32.768 220=1.048.576 225=33.554.432 230=1.073.741.824 ... 2n
Hình 21. Phản ứng PCR với lượng sản phẩm tăng theo cấp số nhân
Ưu điểm của phương pháp PCR
+ Thời gian (6-48 giờ)
+ Phát hiện vsv khĩ nuơi cấy
+ Hĩa chất dễ tìm và dễ bảo quản hơn so với huyết thanh học + Cĩ thể tự động hĩa
Hình 22. Mơ hình máy PCR (Polymerase chain reaction) và máy PCR realtime của Bio-Rad
Nhược điểm
+ Thực phẩm chứa chất ức chế enzyme polymerase + Mật độ vsv trong mẫu thấp, đơi khi cần tăng sinh
+ Khơng phân biệt được tế bào sống và chết, cĩ thể dẫn đến dương tính giả (tuy vậy, cĩ thể phát hiện bào tử, tế bào đã chết của vsv gây độc)
+ Ngày càng được quan tâm nhiều hơn đặc biệt phát hiện virus
Thơng thường khi thực hiện phương pháp PCR, trình tự được tiến hành như sau: - Tăng sinh: vi sinh vật được nuơi cấy tăng sinh trên mơi trường chọn lọc (TSB) 10-20 giờ.
- Tách chiết DNA vi sinh vật - Thực hiện phản ứng PCR
- Điện di trên gel agarose 1,5%, đọc kết quả trên đèn UV.