11. ĐỊNH TÍNH FAECAL STREPTOCOCCUS TRONG THỰC PHẨM 1.Nguyên tắc
4.2. PHƯƠNG PHÁP ELISA (Enzyme-Linked immunosorbent Assay)
Phương pháp ELISA (Phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzyme) dựa trên nguyên tắc là phản ứng kết hợp giữa một tế bào (kháng nguyên) với một kháng thể đặc hiệu. Tín hiệu của phản ứng miễn dịch cĩ thể nhận biết thơng qua sự ngưng tủa hay kết dính của kháng nguyên-kháng thể hoặc bằng những kháng thể đã được đánh dấu (bằng chất nhuộm phát huỳnh quang, đồng vị phĩng xạ hay enzym).
ELISA được mơ tả lần đầu tiên vào năm 1971 và từ đĩ đã trở thành một phương pháp được sử dụng ngày càng rộng rãi và quan trọng hơn trong nghiên cứu, chẩn đốn và xét nghiệm bởi vì nĩ cĩ khả năng phát hiện nhạy bén với một lượng vật chất rất nhỏ.
ELISA đã thay thế một số kỹ thuật huyết thanh “cổ điển“ phức tạp, cồng kềnh tốn nhiều thời gian hơn và mở rộng phạm vi phương pháp phát hiện virus cũng như các marker liên quan đến sự nhiễm của chúng.
Xét nghiệm ELISA cĩ thể được tiến hành với một số phương pháp như ELISA “trực tiếp“, “gián tiếp“, “sandwich“ và “cạnh tranh“.
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp ELISA là kháng nguyên đã hồ tan trong dung dịch đệm thích hợp cĩ thể phủ lên bề mặt plastic (như polystyrene). Quá trình này cĩ thể là trực tiếp hoặc thơng qua một kháng thể. Khi huyết thanh được thêm vào, các kháng thể cĩ thể kết hợp với kháng nguyên ở pha đặc (solid phase).
Xét nghiệm ELISA được thực hiện trong đĩa plastic kích thước 8cm x 12cm, chứa 8x12 giếng. Mỗi giếng cĩ chiều cao khoảng 1cm và đường kính là 0,7cm.
Hình 15: Ðĩa plastic sử dụng để tiến hành xét nghiệm ELISA
Các kháng thể sử dụng trong phương pháp ELISA được gắn với enzyme bằng liên kết đồng hố trị. Kháng nguyên được gắn với giếng plastic và kháng thể liên kết với enzyme được gắn với kháng nguyên. Kháng thể khơng gắn kháng nguyên sẽ bị rửa trơi đi. Enzyme được giữ lại và vì vậy lượng kháng thể gắn enzyme được phát hiện bằng cách cho thêm vào một cơ chất làm thay đổi màu do hoạt tính của enzyme. Ðộ màu tạo thành là tỉ lệ với lượng enzyme bám ở giếng plastic, từ đĩ suy ra lượng kháng thể, sau đĩ tiếp tục suy ra lượng kháng nguyên.
Tính nhạy của ELISA là do sự khuyếch đại bởi hoạt tính enzyme. Mỗi một phân tử enzyme bám vào kháng thể cĩ thể tạo ra hàng ngàn phân tử màu do hoạt tính enzyme. Trước khi các kháng thể gắn enzyme cĩ thể được sử dụng rộng rãi, các kháng thể phĩng xạ đã được sử dụng trong kỹ thuật miễn dịch phĩng xạ (radio immuno assays-RIA). Kỹ thuật RIA như là một đột phá cĩ ý nghĩa và người sáng tạo ra nĩ là Rosalyn Yalow đã được nhận giải thưởng Nobel Sinh lý và Y học vào năm 1977.
Hình 16. Nguyên tắc của phương pháp ELISA
Hình 17. Quy trình thực hiện phương pháp ELISA
Trong phương pháp này, các kháng thể đơn dịng được phủ bên ngồi những đĩa giếng. Nếu cĩ sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ được giữ lại trên bề mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp cĩ gắn với enzym như horseradish peroxidase hay alkaline
phản ứng thuỷ phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm cĩ màu hay phát sáng. Thơng qua việc theo dõi sự đổi màu, cĩ thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên. ELISA đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng các bộ hố chất (kit) thương mại. Hiện nay, đã cĩ các bộ kit dùng cho Salmonella, E. coli gây bệnh, Listeria, Staphylococcus. Độ nhạy của các bộ kit này khoảng 104 CFU/ml, và vẫn cần thực hiện tăng sinh hoặc tăng sinh chọn lọc khi thực hiện phương pháp này. Ngồi ra cịn cĩ các sản phẩm khác như TECRA (Australia) dựa trên nguyên tắc này để định danh độc tố của
Staphylococci trong thịt .
Hình 18. Máy rửa và máy đọc trong quy trình ELISA
4.3.PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ (Hybridization)
Phương pháp lai phân tử cịn được gọi là phương pháp mẫu dị, probes. Phương pháp sử dụng mẫu dị để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm được dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật. Cơ sở của việc sử dụng mẫu dị là quá trình lai phân tử . Quá trình này bao gồm sự tách rời hai mạch đơi của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nĩng chảy (Tm ) của phân tử DNA và sự tái bắt cặp giữa các đoạn DNA cĩ trình tự nucleotide bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường. Một trong hai mạch DNA bổ sung (gọi là DNA mục tiêu là DNA của tế bào vi sinh vật) được cố định trên một giá thể rắn hoặc nằm ngay trên tế bào hay mơ. Sự lai phân tử xảy ra khi đoạn mồi cĩ trình tự nucleotide bổ sung với một vùng trình tự trên DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ mơi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ. Sự lai phân tử cịn cĩ thể xảy ra giữa DNA và RNA. Quá trình lai phân tử chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi các yếu tố: nồng độ DNA của mơi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng, kích thước các trình tự lai và lực ion của mơi trường.