XUẤT LỚN NHẤT (MPN)
3.1.Nguyên tắc
Phương pháp phân tích trong bài này được dựa trên quy trình MPN bằng sử dụng canh Lauryl Sulphate Broth (LSB) vào test đốn chừng (presumptive test), sau đĩ dùng canh Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLB) và ủ ấm ở 37oC/24-48 giờ.
Phương pháp MPN là phương pháp dựa trên nguyên tắc mẫu được pha lỗng thành 1 dãy thập phân (2 nồng độ nối tiếp nhau nhưng khác nhau 10 lần); mỗi nồng độ pha lỗng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại cĩ ống Duharm. Theo dõi sự đục mơi trường và sinh hơi để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha lỗng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhĩm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu.
3.2.Dụng cụ, mơi trường, hĩa chất và thiết bị 3.2.1.Dụng cụ và thiết bị
Bảng 3.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 3
Dụng cụ Thiết bị
Túi dập mẫu Tủ cấy vơ trùng
Đĩa petri (∅100 mm) Nồi hấp
Cốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấm
Đầu tip Pipetman (1000, 5000 µl) Pipetman (1000, 5000 µl)
Que trang Máy dập mẫu (Stomacher)
Ống Durham Máy trộn mẫu (vortex mixer)
Đèn cồn Cân kỹ thuật
Ống nghiệm
Pipette 1 ml, 10 ml
3.2.2.Mơi trường và hĩa chất
Bảng 3.2. Mơi trường và hĩa chất chỉ tiêu 3
Mơi trường Hĩa chất
Dung dịch Saline Peptone Water (SPW)
Cồn 90o và 70o
Lauryl Sulfate Tryptone Broth. HCl 10%
Mơi trường BGBL (Brilliant Green
3.3.Thực hành
3.3.1.Quy trình phân tích
3.3.2.Các bước thực hiện
Bước 1. Cân 10 g mẫu cho vào túi dập mẫu (loại túi dùng cho Stomacher). Đổ 90 ml dung dịch SPW đã vơ trùng vào và đồng nhất mẫu trong 1 phút.
Bước 2. Tuần tự cấy 1 ml dịch mẫu đã pha lỗng 10-1 ( ví dụ dùng loạt pha lỗng liên tiếp 10-1 , 10-2 , 10-3) vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10 ml canh LSB, mỗi ống nghiệm cho 1 ống Durham. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha lỗng 10-2, 10-3.
Bước 3. Ủ ở 37oC trong 48 giờ.
Bước 4. Ghi nhận số ống sinh hơi và canh trường đục. Kết luận các ống LSB (+)
Bước 5. Cấy chuyền 1 ml từ các ống LSB (+) sang canh trường BGBL. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 6. Ủ ở 37oC trong 48 giờ
Bước 7. Ghi nhận số ống sinh hơi và canh trường đục. Kết luận các ống BGBL (+)
3.3.3.Kết quả
Dựa vào số ống BGBL (+) tra bảng MPN, suy ra số lượng coliform tổng
Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha lỗng mẫu để cĩ các độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3…
Chuy n 1ml dung d ch 10ể ị -1, 10-2, 10-3 vào ng 10mlố
canh LBS, m i n ng đ 3 ng l p l i, 37ỗ ồ ộ ố ặ ạ ủ ở 0C,
Ghi nhận các ống LSB (+) ở mỗi nồng độ pha lỗng Chuyển 1 ml dung dịch pha lỗng ở ba nồng độ liên tiếp vào ống nghiệm cĩ 10 ml canh LSB, mỗi nồng độ lặp lại 3 ống, ủ ở 37 ± 1 oC, 48 giờ
Chuyển 1 ml từ LSB (+) sang canh BGBL, ủ 37 ± 1 oC,
48 giờ
Ghi nhận ống BGBL (+) ở mỗi độ lỗng
3.4.Câu hỏi thảo luận
1.Trong Coliforms tổng cĩ các giống vi sinh vật nào?
2. Nêu nguyên tắc của phương pháp MPN? Viết tắt của MPN? 3. Nêu vai trị của các thành phần trong mơi trường LSB và BGB
4.ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN
4.1.Nguyên tắc
Từ Coliforms được Blachstein sử dụng đầu tiên vào năm 1893 để nói về những vi khuẩn Bacilli có đặc điểm hình thái giống E. coli.
Coliforms tổng cộng là những trực khuẩn đường ruột, gram (-), không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở35oC - 37oC trong 24-48 giờ. Nhóm Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật. Số lượng Coliforms trong mẫu được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác, mặc dù điều này còn nhiều tranh cãi. Nhóm Coliforms gồm bốn giống là: Escherichia với một loài duy nhất là E. coli; Citrobacter; Klebsiella và Enterobacter.
Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi khi ủ ở 44oC/24h trong môi trường EC.
Coliforms phân (Faecal Coliforms hay E. coli giả định) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi ủ ở 44.5oC/24h trong tryptone.
Escherichia coli lần đầu tiên được Escherich phân lập từ phân người vào năm 1855. Đây là vi khuẩn được chú ý nhiều và nghiên cứu kỹ lưỡng nhất. Chúng cư trú ở đường ruột của người và động vật máu nóng. Chúng có thể là vi khuẩn gây bệnh cơ hội. E. coli là vi sinh vật chỉ thị tiêu biểu nhất. Sự có mặt cũng như số lượng của chúng chỉ ra mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống cũng như sự ô nhiễm phân trong môi trường. Từ năm 1982 đã phát hiện thấy 4 loài E. coli có khả năng gây bệnh có nguồn gốc thực phẩm (Enteropathogenic-EPEC; Enteroinvasive-EIEC; Enteroinvasive- EIEC; Enterotoxigenic – ETEC, trong đó có chủng O157:H7). Bài thực hành này chỉ giới hạn ở việc xác định E. coli như một vi sinh vật chỉ thị thực phẩm.
Phương pháp phân tích trong bài này được dựa trên quy trình MPN bằng sử dụng canh thang Lauryl sulphate tryptose (LST) vào test đoán chừng (presumptive test), sau đó dùng canh thang BGLB (Brilliant Green Lactose Bile Broth) và ủ ấm ở 37oC/24-48 h (để kiểm tra Coliforms). Tiếp theo chuyển sang môi trường canh EC (E. coli medium) ủ ở 44.5oC để kiểm tra Coliforms chịu nhiệt. Sau đó xác định Coliforms phân (E. coli giả định) bằng cách cấy sang môi trường EMB (Eosine Methylene Blue Agar), chọn khuẩn lạc điển hình và thử khả năng sinh Indol (I). Để xác định E. coli cần thử ba phản ứng sinh hóa tiếp theo là Methyl Red (MR), Voges-Proskeur (VP) và Citrate (iC). E. coli là Coliforms phân và cho kết quả thử nghiệm IMViC là + + - -.
4.2.Dụng cụ, thiêt bị, mơi trường, hĩa chất 4.2.1.Dụng cụ và thiết bị
Bảng 4.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 4
Dụng cụ Thiết bị
Túi dập mẫu Tủ cấy vơ trùng
Đĩa petri (∅100 mm) Nồi hấp
Cốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấm
Đầu tip Pipetman (1000, 5000 µl) Máy dập mẫu (Stomacher)
Ống Durham Máy trộn mẫu (vortex mixer) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đèn cồn Cân kỹ thuật
Ống nghiệm Micropipet
4.2.2.Mơi trường và hĩa chất
Bảng 4.2.. Mơi trường và hĩa chất chỉ tiêu 4
Mơi trường Hĩa chất
Dung dịch Saline Pepton Water(SPW)
Cồn 90o và 70o
Lauryl Sulfate Tryptone Broth. HCl 20%
Mơi trường BGBL (Brilliant Green
Lactose Bile Salt) NaOH 20%
Môi trường Tryptic Soya Agar (TSA)
Thuốc thử Kovac’s
Môi trường EMB (Eosine Methylen Blue agar)/ Endo
Thuốc thử Metyl Red Môi trường MRVP (Metyl Red
Voges Prokauer
Dd creatine 0,5 %
Môi trường thạch Simons Citrat Dung dịch α- naphtol 5% Môi trường Trypton Water (TW) KOH 40%
Thuốc thử Kovac
HCl 10% NaOH 10%
4.3.Thực hành
4.3.1.Quy trình phân tích
Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha lỗng mẫu để cĩ các độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3…
Ghi nhận các ống LSB (+) ở mỗi nồng độ pha lỗng
Chuyển 1 ml dung dịch pha lỗng ở ba nồng độ liên tiếp vào ống nghiệm cĩ 10 ml canh LSB, mỗi nồng độ lặp lại 3 ống, ủ ở 37 ± 1 oC, 48 giờ
Chuyển 1 ml từ LSB (+) sang canh EC, ủ 44,5 ± 0,2 oC, 24giờ
Ghi nhận số ống (+) ở mỗi độ lỗng
Cấy lên thạch EMB, ủ 37 ± 1 oC, 24 giờ
Chọn khuẩn lạc dẹt, hình dĩa, có ánh kim tím, đường kính ≥ 1mm để cấy sang TSA/BHI, ủ 37 ± 1 oC, 24 giờ
Thử nghiệm IMViC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đếm số canh EC (+) và IMViC(++--), tra bảng MPN
4.3.2.Các bước thực hiện
Bước 1.Cân 10 g mẫu cho vào túi dập mẫu (loại túi dùng cho Stomacher). Đổ 90 ml dung dịch SPW đã vơ trùng vào và đồng nhất mẫu trong 1 phút.
Bước 2.Tuần tự cấy 1 ml dịch mẫu đã pha lỗng 10-1 ( ví dụ dùng loạt pha lỗng liên tiếp 10-1 , 10-2 , 10-3) vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10 ml canh LSB, mỗi ống nghiệm cho 1 ống Durham. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha lỗng 10- 2, 10-3. Ủ ở 37oC trong 48 giờ.
Bước 3.Ghi nhận số ống sinh hơi và canh trường đục. Kết luận các ống LSB (+)
Bước 4.Cấy chuyền 1 ml từ các ống LSB (+) sang canh trường EC. Ủ 44,5 ± 0,2oC, 24giờ.
Bước 5.Ghi nhận số ống sinh hơi và canh trường đục. Kết luận các ống EC (+)
Bước 6.Dùng que cấy vịng ria dịch mẫu từ các ống (+) trên mơi trường canh EC sang mơi trường thạch đĩa EMB/ Endo . Ủ các đĩa 37oC, 24giờ.
Nhân dạng khuẩn lạc E.coli:
- Trên môi trường EMB: khuẩn lạc màu tím, ánh kim, tròn, bờ đều, đường kính khoảng 1mm
- Trên môi trường Endo: Khuẩn lạc màu đỏ, ánh kim, tròn, bờ đều, đường kính khoảng 1mm
Bước 7. Chọn khuẩn lạc E.coli giả định trên EMB/Endo cấy vào TSA/BHI, ủ qua đêm
Bước 8.Cấy chuyển từ mơi trường TSA/BHI vào các mơi trường thử nghiệm sinh hĩa Trypton broth, MR- VP, SC. Ủ 44,5 ± 0,2 oC, 24giờ.
Bước 9. Thử phản ứng sinh hóa .Thử nghiệm IMViC
Phản ứng Indol: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 5ml
Trypton broth, ủ 370C trong 24giờ. Cho thêm 0,5ml thuốc thử Kovac bằng cách cho chảy dọc theo thành ống nghiệm
Hình 4.2 : E.coli trên mơi trường EMB Hình 4.1 : Các ống EC (+)
+ Môi trường không đổi màu: indol (-)
Phản ứng MR (metyl red): Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào 2 ống nghiệm,
mỗi ống chứa 5ml môi trường MRVP để ở 370C từ 48 – 96 giờ. Một ống thử phản ứng Methyl red, một ống thử phản ứng VP.
Cho vào một ống nghiệm vài giọt metyl red ở pH trung tính hoặc kiềm yếu
+ Môi trường chuyển màu đỏ: MR (+) + Môi trường không đổi màu: MR (-)
Phản ứng VP (Voges Proskauer) Cho vào ống nghiệm chứa môi trường
MRVP còn lại khoảng 0,6ml dung dịch α- naphtol và 0,2ml dung dịch kalihydroxyt 40%, lắc đều, để yên trong 2h.
+ Môi trường đổi sang màu đỏ eosin hoặc có vệt đỏ eosin phát triển trong vòng 15 phút : VP (+)
+ Môi trường không chuyển màu đỏ: VP (-)
Phản ứng citrat: Cấy ria khuẩn lạc nghi ngờ lên
mặt nghiêng của môi trường simon citrat, để ở 370C trong 24h.
+ Môi trường đổi màu lục sang xanh dương và có khuẩn lạc: citrat (+)
+ Môi trường không đổi màu, không mọc khuẩn lạc: citrat (-) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.3.3.Kết quả
Ống nghiệm cho kết quả EC (+), và khuẩn lạc E.coli giả định trên mơi trường EMB cho kết quả thử nghiệm IMViC (++-- ) là ống nghiệm cĩ E.coli (+). Từ số lượng các ống cĩ E.coli (+) ở mỗi độ pha lỗng của mẫu tra bảng MPN để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay MPN/ml
5. ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM
5.1.Nguyên tắc
Salmonella được phát hiện từ 1880, đại đa số là vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm và gây bệnh (sốt thương hàn). Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, trực trùng gram âm, hô hấp tùy tiện, có khả năng di
50
động, không tạo bào tử, lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh indole, không phân giải urea, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H2S. Các loại thực phẩm đều yêu cầu phải kiểm nghiệm Salmonella với tiêu chuẩn không phát hiện/25 g(ml)
Như vậy việc xác định thông thường chỉ dừng ở mức độ định tính, tên chủng chỉ được xác định trong những trường hợp quan trọng. Cần lưu ý Salmonella là nhóm chứa các dòng gây bệnh nguy hiểm, do vậy cần tuân thủ triệt để các biện pháp an toàn khi làm việc với các chủng đối chứng (+) cũng như khi thao tác trên các chủng phân lập được. Các môi trường hay mẫu vật sau khi nuôi cấy cần phải hấp khử trùng cẩn thận trước khi rửa. Do trong thực phẩm Salmonella thường tồn tại ở số lượng ít, tế bào có thể bị tổn thương do đó quy trình xét nghiệm thông thường gồm 4 bước: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định.
5.2.Dụng cụ, thiêt bị, mơi trường và hĩa chất 5.2.1..Dụng cụ và thiết bị
Bảng 5.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 5
Dụng cụ Thiết bị
Ống nghiệm Tủ cấy vơ trùng
Đĩa petri (∅100 mm) Nồi hấp
Cốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấm
Đầu tip Pipetman (1000, 5000 µl) Pipetman (1000, 5000 µl)
Que trang, que cấy vịng Máy dập mẫu (Stomacher)
Kẹp inox Máy trộn mẫu (vortex mixer)
Đèn cồn Cân phân tích
Pipette 1 ml, 10 ml Lị viba
5.2.2.Mơi trường và hĩa chất
Bảng 5.2.Mơi trường và hĩa chất chỉ tiêu5
Mơi trường Hĩa chất
Dung dịch Buffered Peptone Water (BPW) Cồn 90o và 70o
Canh Rappaport-Vassiliadis Soya Pepton (RV) Dd creatine 0,5 %
Selenit xystin / Tetrathionat (TT) Dung dịch α- naphtol 5%
Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) KOH 40%
Mơi trường Hektoen Entric Agar (HE) Thuốc thử Kovac
Môi trường Trypticase Soy Agar (TSA) HCl 10%
Môi trường Lysine Decacboxylase broth (LDC)
5.3.Thực hành (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
5.3.1.Quy trình phân tích
5.3.2.Các bước tiến hành Bước 1. Tăng sinh
- Cân 25g mẫu đã nghiền, hoặc hút 25 ml mẫu cho vào bình đã chứa sẵn 225ml môi trường BPW, lắc đều để ở 370C trong 24 giờ.
Bước 2. Tăng sinh chọn lọc
- Hút 1ml canh khuẩn BPW sang môi trường RV, nuôi trong 24 giờ ở 42oC.
- Hút 1ml canh khuẩn BPW sang môi trường Selenit-cystin/TT, nuôi trong 24 giờ ở 37oC.
Bước 3. Phân lập và nhận diện
- Dùng que cấy vòng cấy ria canh trường từ môi trường tăng sinh chọn lọc
lên đĩa petri chứa môi trường phân lập. Cần cấy thưa để tạo khuẩn lạc riêng biệt. Để ở 370C trong 24 giờ. Trên các môi trường phân lập. Trên môi trường XLD,
Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 mơi trường chọn lọc phân biệt XLD, HE, BS, SS…
Chuy n 1ml dung d ch 10ể ị -1, 10-2, 10-3 vào ng 10ml ố
canh LBS, m i n ng đ 3 ng l p l i, 37ỗ ồ ộ ố ặ ạ ủ ở 0C, 48 giờ
Thử nghiệm sinh hĩa cho kết quả:
- KIA/TSI: đỏ/vàng, cĩ /khơng H2S, sinh hơi/khơng
- Urea (-), Indol (-), VP (-) - LDC (+),ONPG (-)
Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cấy sang canh BHI hoặc thạch TSA, ủ qua đêm, 37 oC
5
Thử nghiệm ngưng kết kháng nguyên huyết thanh:
( ngưng kết với ít nhất một trong hai kháng huyết thanh đa giá OMA,OMB) Cấy 1 ml canh khuẩn BPW sang RV, ủ 42 oC, 18 -24 g; và sang Selenit cystein/TT ,ủ 370C /
24g Đồng nhất 25 g mẫu trong 225 ml dung dịch BPW
Ủ 37 oC, 18 – 24 giờ
Salmonella dương tính/âm tính trên 25g(ml) thực phẩm
Salmonella tạo các khuẩn lạc đỏ hồng, có hoặc không có tâm đen. Trên môi trường HE khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu xanh lam, có hoặc không có tâm đen
\
Bước 4. Thử phản ứng sinh hĩa Thử nghiệm TSI/KIA):
Mơi trường KIA được sử dụng để thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng sinh H2S.
Cấy đâm sâu phần cột thạch và cấy ria lên phần thạch nghiêng vi khuẩn từ những khuẩn lạc điển hình/nghi ngờ lên ống thạch nghiêng chứa môi trường KIAø. Ủ ở 370C trong 24 giờ.
Diễn giải sự biến đổi môi trường như sau:
Cột thạch:
- Màu vàng: glucose dương tính (lên men glucose) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Màu đỏ hoặc không đổi màu: glucose âm tính (không lên men glucose) - Màu đen: có tạo thành sunfua hidro
- Có bọt khí hoặc có vết nứt : sinh khí từ glucose
Bề mặt thạch nghiêng:
- Màu vàng: lactose/saccharose dương tính (có sử dụng lactose/saccharose) - Màu đỏ hoặc không đổi màu: lactose/saccharose âm tính
Thử nghiệm LDC
Lấy một que cấy đầy khuẩn lạc trên mơi trường TSA cấy ngay dưới bề mặt của mơi trường lỏng LDC, Ủ ở 370C trong 24 giờ
Hình 5.2. Khuẩn lạc Salmonella trên mơi trường XLD (trái), HE (phải)