11. ĐỊNH TÍNH FAECAL STREPTOCOCCUS TRONG THỰC PHẨM 1.Nguyên tắc
4.4.1.Các thành phần chủ yếu của phản ứng PCR
a. DNA mẫu (DNA template)
Ðây là mẫu DNA sinh học mà chúng ta muốn khuyếch đại. Phản ứng PCR tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng phản ứng PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Lượng mẫu DNA sử dụng cĩ khuynh hướng giảm khi sử dụng các enzyme DNA polymerase cho hiệu quả cao (<100ng).
Lượng DNA mẫu nếu cao quá phản ứng PCR sẽ khơng xảy ra. PCR cịn cho phép khuyếch đại cả những mẫu DNA khơng được bảo quản tốt, các mẫu DNA đã bị phân hủy từng phần như ở các vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khơ, tĩc, mĩng tay của người chết....
b. Mồi (primer)
Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA . Chúng nhận ra phần DNA cần được nhân lên, bắt cặp bổ sung với một đầu của DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản. Các mồi này cĩ chiều ngược nhau, bao gồm một mồi xuơi (forward primer) và một mồi ngược (reverse primer).
Mồi là yếu tố quan trọng nhất của phản ứng PCR, quyết định hiệu quả của phản ứng. Do đĩ việc thiết kế mồi cần được tuân thủ một số nguyên tắc nhất định:
+ Cả hai mồi trong một phản ứng PCR phải cĩ nhiệt độ nĩng chảy (Tm) gần như nhau bởi vì chúng được ủ ở cùng một nhiệt độ.
+ Kích thước tối thiểu của mồi là 18 base (thơng thường là 18-24 base) để quá trình lai xảy ra tốt hơn.
+ Mồi phải đặc hiệu cĩ nghĩa là nĩ phải đặc trưng cho trình tự DNA cần được khuyếch đại, một mồi chỉ bám vào một vị trí nhất định trên gen.
+ Khơng cĩ nút cài tĩc (hairpin loop): trong mỗi một mồi cần tránh trình tự đối xứng bậc hai (palindromic sequences) cĩ thể làm tăng cấu trúc sợi bên trong ổn định do đĩ hạn chế việc mồi bám vào DNA mẫu.
+ Tránh sự bổ sung giữa hai mồi: sự bổ sung giữa hai mồi sẽ làm tăng sản phẩm primer dimer (Hình 3.7).
+ Trật tự các base cũng ảnh hưởng đến sự ổn định việc bám của mồi dưới nhiệt độ cao. Hai trong ba base ở đầu 3’ của mồi nên là G hoặc C, vì G và C cĩ 3 liên kết hydro do đĩ sự polymer hố sẽ tốt hơn.
+ Khoảng cách tối ưu giữa hai mồi: đây là một ứng dụng rất đặc trưng, nhưng đối với phần lớn các thử nghiệm PCR chẩn đốn, tốt nhất khoảng cách giữa hai mồi
khi đã bám vào DNA khuơn là 150-500 base. c. Enzyme polymerase chịu nhiệt
Enzyme ssử dụng trong phản ứng PCR là enzyme DNA polymerase từ
Thermus aquaticus (Tag-polymerase) khơng biến tính sau mỗi chu kỳ. DNA polymerase chịu nhiệt sử dụng cho phản ứng PCR lần đầu tiên được bán trên thị trường là Tag-polymerase. Hiện nay cĩ nhiều enzyme chịu nhiệt khác được sử dụng là: Vent- polymerase (Tli-polymerase), Pfu- polymerase, rTth...Các hoạt tính của chúng được trình bày ở bảng:
Enzyme Hiệu suất tương đối (Relative efficiency) Tần số lỗi (Error rate) Tần số mở rộng (Extention rate) Exo 3’-5’ Exo 5’-3’ Taq-polymerase Vent- polymerase Pfu- polymerase rTth 88 70 60 Khơng XĐ 2x10-4 4x10-5 7x10-7 Khơng XĐ 75 67 Khơng XĐ 60 Khơng Cĩ Cĩ Khơng Cĩ Khơng Khơng Cĩ d. Các loại nucleotid
Trong phản ứng PCR, bốn loại nucleotid thường được sử dụng ở dạng deoxynucleotid: dATP, dCTP, dGTP, dTTP với nồng độ cân bằng trong một phản ứng (200μM/loại nucleotid).
e. Nước
Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, khơng chứa ion nào, khơng chứa DNAase, RNAase, enzyme cắt hạn chế... Nĩi cách khác là khơng chứa bất kỳ một thành phần nào khác.
f. Dung dịch đệm
Dung dịch đệm 10X (100mM KCl, 100mM (NH4)2SO4, 200mM Tris- Cl pH 8.8, 20mM MgSO4, 1% (w/v) Triton X-100)
g. Ion Mg2+
Nồng độ ion Mg2+ cũng là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR và nĩ tuỳ thuộc vào từng phản ứng. Nồng độ ion Mg2+ tối ưu là 150-200 μM. Người ta thấy rằng nếu nồng độ DNA quá cao thì enzyme polymerase sẽ gây ra nhiều lỗi hơn.