7.1. Nguyên tắc:
B.cereus là những trực khuẩn, Gram dương, hiếu khí, kỵ khí tùy ý, di động, tạo nội bào tử, lên men glucose sinh hơi, phản ứng VP(+). Có khả năng sử dụng nitrat. B.cereus có thể tiết ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa.
Loài này tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ tử 5-500C, tối ưu ở 35-400C, pH dao động từ 4,5-9,3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng. Trên môi trường chọn lọc loài này tạo khuẩn lạc rất to, mọc lan, rìa nhăn. Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khô...).
B.cereus được phát hiện và định lượng bằng môi trường thạch chọn lọc Manitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP) hoặc Cereus Selective Agar (Mossel). Khuẩn lạc B.cereus có hình thái đặc trưng trên các môi trường này. Các khuẩn lạc này được tiếp tục khẳng định dựa trên các thử nghiệm sinh hóa và các đặc điểm như lên men glucose sinh acid trong điều kiện kỵ khí, khử nitrat thành nitrit, thử nghiệm VP(+), thủy phân L-tyrosine, tăng trưởng được trong 0,001% lysozym
7.2.Dụng cụ, thiết bị, mơi trường, hĩa chất 7.2.1.Dụng cụ và thiết bị
Bảng 7.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 7
Dụng cụ Thiết bị
Ống nghiệm Tủ cấy vơ trùng
Đĩa petri (∅100 mm) Nồi hấp
Cốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấm
Đầu tip Pipetman (1000, 5000 µl) Pipetman (1000, 5000 µl)
Micropipet Máy dập mẫu (Stomacher)
Que trang, que cấy vịng Máy trộn mẫu (vortex mixer)
Kẹp inox Cân kỹ thuật
Đèn cồn Lị viba
7.2.2.Mơi trường và hĩa chất
Bảng 7.2. Mơi trường và hĩa chất chỉ tiêu 7
Mơi trường Hĩa chất
Nước đệm Salin Pepton Water (SPW) / Buffered
Petone Water (BPW) Cồn 90o và 70o
Dd creatine 0,5 %
Manitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP) /Cereus Selective Agar (Mossel)
Dung dịch α- naphtol 5%
Nhũ lịng đỏ trứng (EGG YOLK Emulsion),50% KOH 40%
Canh Phenol Red Glucose
Thạch Tyrosine HCl 20%
Canh Lysozyme NaOH 20%
Mơi trường MRVP Griess – Ilowvay’s reagent
MANNITOL MOBILITY NITRATE Bụi kẽm
Thạch dinh dưỡng Nutrient Agar/ Tryptic Soya
Agar(TSA) Hĩa chất nhuộm Gram
Nutrient broth polymyxin B 0,1%
Tyrosine 5%, lysozyme 0,1%
7.3.Thực hành
7.3.1.Quy trình phân tích
10 g mẫu + 90 ml dung dịch đệm 10-1
Tiếp tục pha lỗng mẫu đến 10-210-310-4 ...
Cấy trải 0,1ml mẫu lên mơi trường MYP, ủ 300C, 24-48 giờ
Cấy 05 khuẩn lạc nghi ngờ lên TSA, ủ 300C qua đêm
Thử sinh hĩa các khuẩn lạc nghi ngờ:
Thử khả năng chuyển hĩa nitrat thành nitrit (+),thử VP(+), thử lên men glucose(+), thử nghiệm tyrosin(+), thử nghiệm Lysozyme(+)
7.3.2. Các bước thực hiện
Bước 1.Pha lỗng mẫu
Mẫu đưa về phòng thí nghiệm, mở ra cho vào khay vô trùng. Dùng kéo và kẹp vô trùng lấy đại diện 10g mẫu cho vào bao PE vô trùng trong điều kiện vô trùng. Mẫu được đồng nhất với 90ml dung dịch đệm phosphat bằng máy dập mẫu để có dung dịch pha loãng 10-1.
Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch pha loãng 10-1 sang ống nghiệm chứa 9ml dung dịch đệm phosphat để được dung dịch pha loãng 10-2. Tùy theo mức độ nhiễm bẩn của mẫu mà tiến hành pha loãng ở các độ pha loãng cao hơn.
Bước 2. Cấy mẫu lên môi trường MYP
Chọn 2 nồng độ pha loãng thích hợp, hút 0,1ml dịch pha loãng vào mỗi đĩa MYP (mỗi nồng độ 2 đĩa). Dùng que gạt trải cẩn thận chất nuôi càng nhanh càng tốt. Ủ 30oC, 24 – 48 giờ.
Bước 3. Khẳng định Bacillus cereus bằng các phản ứng sinh hóa
Chọn và đếm các đĩa có từ 15 – 150 khuẩn lạc đặc trưng của Bacillus aureus
(dẹt, đường kính 2 – 3mm, bờ hình răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vòng đục). Chuyển 5 khuẩn lạc nghi ngờ này lên môi trường phục hồi TSA , ủ ở 30oC qua đêm trước khi tiến hành các thử nghiệm sinh hoá.
- Thử nghiệm khả năng lên men glucose: cấy vi khuẩn từ môi trường TSA sang môi trường canh glucose, ủ 35oC trong 24 giờ. Bacillus cereus cho phản ứng dương tính làm đổi màu môi trường từ đỏ sang vàng.
- Thử nghiệm khả năng chuyển hóa nitrat thành nitrit: cấy vi khuẩn từ môi trường TSA sang môi trường nitrat, ủ ở 35oC trong 24 giờ. Bacillus cereus có phản ứng dương tính nên sau khi nhỏ thuốc thử vào canh khuẩn chuyển sang màu đỏ cam trong 10 phút.
- Thử nghiệm Voges – proskauer: cấy vi khuẩn từ môi trường TSA sang môi trường canh MR - VP, ủ ở 35oC trong 48 giờ. Bacillus cereus cho phản ứng dương tính: môi trường chuyển sang màu hồng khi cho thuốc thử α-Naphthol vào (trước khi nhỏ α-Naphthol vào phải làm kiềm hóa môi trường nuôi cấy bằng KOH 40%).
- Thử nghiệm Tyrosin: cấy vi khuẩn từ môi trường TSA sang ống thạch nghiêng Tyrosin, ủ 35oC trong 48 giờ. Khuẩn lạc Bacillus phân hủy tyrosin tạo khoảng trong xung quanh khuẩn lạc.
- Thử nghiệm Lysozyme: cấy vi khuẩn từ môi trường TSA sang ống nghiệm chứa môi trường Nutrient Broth với 0,001% lysozyme, ủ 35oC trong 24 giờ. Bacillus
phát triển làm môi trường đục đều.
7.3.3. Đọc kết quả:
Số Bacillus cereus trên 1g mẫu = nN×V××Rf N: tổng số khuẩn lạc đếm được
n: số lượng đĩa đếm f: độ pha loãng tương ứng
V: thể tích dịch mẫu cấy vào trong mỗi đĩa
R: tỉ lệ xác nhận = tỉ lệ giữa số khuẩn lạc nghi ngờ cho thử nghiệm dương tính so với số khuẩn lạc nghi ngờ.