8.1.Nguyên tắc:
Giống Clostridium là các vi khuẩn Gram dương, hình que, kỵ khí, sinh bào tử, phần lớn di động. Clostridium perfringens là loài kỵ khí không bắt buộc, tạo các khuẩn lạc màu đen trong môi trường phân lập quy định
Clostridium perfringens là vi khuẩn chỉ sự ơ nhiễm do phân người, động vật, bùn đất, nước cống rãnh. Vi khuẩn cĩ bào tử và cĩ sức đề kháng cao. Nếu thực phẩm chế biến khơng đảm bảo vệ sinh, nhiệt độ khử khuẩn, đun nấu khơng đủ diệt bào tử, vi khuẩn vẫn cịn tồn tại và phát triển, làm hư hỏng thực phẩm và gây ngộ độc thức ăn ( nhất là thực phẩm đồ hộp)
Do tính chất của Clostridium perfringens là phát triển trong mơi trường kỵ khí và cĩ khả năng phân giải Sodium sulfit hoặc phân giải protein tạo H2S.
Cấy trên mơi trường cĩ Sodium sulfit và phèn sắt ( mơi trường thạch Tryptose Sulfide Cycloserin:TSC), tạo khuẩn lạc màu đen, thử tính chất sinh hĩa để định danh
8.2.Dụng cụ, thiết bị, mơi trường, hĩa chất 8.2.1.Dụng cụ và thiết bị
Bảng 8.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 8
Dụng cụ Thiết bị
Ống nghiệm Tủ cấy vơ trùng
Đĩa petri (∅100 mm) Nồi hấp
Cốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấm
Đầu tip Pipetman (1000, 5000 µl) Pipetman (1000, 5000 µl)
Micropipet Máy dập mẫu (Stomacher)
Que trang, que cấy vịng Máy trộn mẫu (vortex mixer)
Kẹp inox Cân kỹ thuật
Đèn cồn Lị viba
Pipette 1 ml, 10 ml Bình kỵ khí
8.2.2.Mơi trường và hĩa chất
Bảng 8.2. Mơi trường và hĩa chất chỉ tiêu 8
BASE (TSC)
MANNITOL MOBILITY NITRATE Dd creatine 0,5 %
THIOGLYCOLATE Dung dịch α- naphtol 5%
GELATINE-LACTOSE KOH 40%
IRON SULPHITE AGAR (ISA) Thuốc thử Kovac
HCl 10% NaOH 10%
C.selective supplement Anaerobic indicator Túi kỵ khí
Griess – Ilowvay’s reagent Bụi kẽm
8.3.Thực hành
8.3.1. Quy trình phân tích
Lấy 01 ml mẫu vào đĩa, rĩt khoảng 20ml mơi trường TSC, xoay đều, đợi đơng, phủ thêm lên bề mặt đĩa 10ml mơi trường TSC, ủ 370C ± 10C, 20giờ trong bình kỵ khí
Chọn 10 khuẩn lạc điển hình từ các đĩa đã đếm. Cấy ria các khuẩn lạc này lên mơi trường thạch TSC cơ bản, phủ thêm 10 ml mơi trường TSC cơ bản, ủ 370C ± 10C, 20giờ trong bình kỵ khí
Thử sinh hĩa các khuẩn lạc điển hình:
Thử nghiệm tính di động, thử nghiệm sự cĩ mặt của nitrit, thử nghiệm sự hĩa lỏng geletin, lên men lactose
10 g mẫu + 90 ml dung dịch đệm 10-1
Tiếp tục pha lỗng mẫu đến 10-210-310-4 ...
8.3.2.Các bước thực hiện
Bước 1: Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha lỗng mẫu để cĩ các độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3…
Bước 2:Dùng pipet vơ trùng để lấy ở mỗi nồng độ pha lỗng 1 ml dung dịch huyền phù ban đầu hoặc 1 ml mẫu thử ( nếu mẫu là chất lỏng) cho vào giữa đĩa Petri, mỗi nồng độ 02 đĩa.
Bước 3: Rĩt 15-20 ml mơi trường TSC vào đĩa Petri và trộn đều bằng cách xoay nhẹ.
Bước 4: Khi mơi trường đã đơng chặt, rĩt thêm một lớp 10 ml mơi trường TSC phủ lên trên.
Bước 5: Để đơng và xếp các hộp Petri nắp ở phía trên vào bình kỵ khí, Bước 6: Đếm và ghi lại số lượng khuẩn lạc điển hình ở các đĩa. Khuẩn lạc Clostridium perfringens
cĩ màu đen
Xác nhận
Chọn tổng số 10 khuẩn lạc điển hình từ các đĩa đã đếm. Nếu khơng cĩ khả năng tách riêng rẽ tốt các khuẩn lạc điển hình thì nuơi 10 khuẩn lạc điển hình đĩ trong mơi trường lỏng thioglycolate, nuơi dưỡng trong điều kiện yếm khí ủ 370C ± 10C, 18-24 giờ.
Cấy ria các khuẩn lạc này trên mơi trường thạch cơ bản TSC, phủ thêm một lớp 10 ml mơi trường TSC cơ bản. Để đơng và nuơi yếm khí ủ 370C ± 10C, 18-24 giờ.
Tách ở mỗi đĩa ít nhất một khuẩn lạc điển hình và dễ tách biệt. Xác nhận tính sinh hĩa
Thử nghiệm tính di động : Làm mơi trường thạch đứng Mannitol Mobility Nitrate. Cấy sâu khuẩn lạc đã phân lập vào mơi trường . Nuơi dưỡng trong điều kiện yếm khí 370C ± 10C, 18-24 giờ.
Kiểm tra ống mơi trường để xem dạng sinh trưởng dọc theo đường cấy sâu. Sự sinh trưởng khuyếch tán vào mơi trường từ vết cấy sâu thể hiện rõ tính di động của vi sinh vật nuơi cấy
Thử nghiệm sự cĩ mặt của nitrit: Thêm 0,2-0,5 ml thuốc thử phát hiện nitrit vào mỗi ống mơi trường nitrat di động (tiến hành trong tủ HOP). Sự hình thành màu đỏ xác nhận phản ứng khử nitat thành nitrit. Nếu trong 15 phút mà màu đỏ khơng hình thành thì thêm một lượng nhỏ bột kẽm. Để yên 10 phút, nếu màu đỏ được hình thành sau khi thêm bột kẽm thì khơng cĩ phản ứng nitrat thành nitrit.
Xác định sự hĩa lỏng geletin:
Cấy các khuẩn lạc đã phân lập vào ống nghiệm chứa mơi trường gelatin-lactose. Nuơi dưỡng trong điều kiện yếm khí ủ 370C ± 10C, 18-24 giờ. Kiểm tra ống mơi trường xem cĩ sự sinh khí và cĩ chuyển màu vàng khơng ( tạo acide) cho biết sự lên men của lactose. Làm lạnh 1 giờ ở 50C và kiểm tra sự hĩa lỏng của geletine. Nếu mơi trường vẫn rắn, nuơi cấy thêm 24 giờ và kiểm tra sự hĩa lỏng của geletine.
Vi sinh vật sinh ra các khuẩn lạc đen ở mơi trường TSC, khơng di động, khử nitrat thành nitrit, sinh acide và khí từ lactose, hĩa lỏng geletin trong 48 giờ được coi là Clostridium perfringens
8.3.3. Đọc kết quả
Vi sinh vật sinh ra các khuẩn lạc đen ở mơi trường TSC, khơng di động, khử nitrat