3. Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang
2.7. THỬ NGHIỆM SINH HĨA
Trong kỹ thuật phân tích vi sinh vật, sau khi phân lập, việc định danh vi sinh vật là một vấn đề rất quan trọng. Việc định danh này được thực hiện dựa và các đặc điểm về kiểu hình, đặc biệt là các phản ứng sinh hố thực hiện bởi các chủng vi sinh vật. Thơng thường để thực hiện các phản ứng sinh hố cĩ thể tiến hành theo một trong ba cách là cách truyền thống, sử dụng bộ KIT và dùng thiết bị tự động.
Trong các thử nghiệm sinh hố, để đảm bảo chính xác trong việc đọc kết quả, người ta thường thực hiện thử nghiệm trên các chủng đối chứng. Một số chủng đối chứng cho các thử nghiệm sinh hố thường dùng được trình bày trong bảng sau:
Tên chủng Mã số NCTC Mã số ATCC Acinetobacter calcoaceticus Aci. lwoffi 7844 5886 15308 15306 Aeromonas hydrophila 8049 7966 Alkaligenes faecalis 415 19018 Bacillus cereus Bac. subtilis 10876 6633 7464 10400 Clostridium histolyticum Clos. Perfringens 19401 13124 503 8237 Edwardsiella tarda 10396 19547 Enterobacter aerogenes Ent. cloacae 13048 10005 10006 - Enterococcus faecalis 29212 - Escherichia coli 25922 10418 Mycobacterium fortuitum Myco. kansasii Myco. phlei Myco. terrae 10349 10268 8151 10856 6841 14471 19249 15755 Norcadia brazilensis Nor. otitidicarcaviarum 11274 1934 19296 14629 Proteus mirabilis Pro. rettgeri 10975 7475 - - Pseudomonas aeruginosa 10662 Serratia marcescens 13880 10218 Staphylococcus aureus Staph. epidermidis 25923 12228 6571 - Streptococcus agalactiae 13813 8181
Tên chủng Mã số NCTC Mã số ATCC Strep. pneumoniae Strep. salivarius 6303 8681 - 7073
Các thử nghiệm sinh hố quan trọng thường sử dụng trong phân tích vi sinh vật bao gồm như sau:
1. Thử nghiệm khả năng lên men
Thử nghiệm khả năng lên men là thử nghiệm dùng để xác định khả năng sử dụng một nguồn carbon nhất định bởi vi sinh vật để tăng trưởng theo con đường lên men. Tùy theo vi sinh vật và nguồn cơ chất muốn kiểm tra cĩ thể bổ sung vào mơi trường nuơi cấy những nguồn cơ chất khác nhau. Sản phẩm tạo thành từ quá trình sống này sẽ làm giảm pH của mơi trường nuơi cấy và từ đĩ làm thay đổi màu của chất chỉ thị màu được bổ sung vào mơi trường.
Chất chỉ thị màu thường sử dụng trong thử nghiệm là phenol red. 2. Thử nghiệm khả năng oxy hố-lên men
Thử nghiệmkhả năng oxy hố – lên men nhằm mục đích xác định vi sinh vật biến dưỡng nguồn carbon hydrat theo con đường lên men hay hơ hấp. Phản ứng được xác định dựa trên sản phẩm tạo thành từ quá trình sống của vi sinh vật và cĩ thể làm chuyển màu của chất chỉ thị màu bổ sung vào mơi trường theo những cách khác nhau.
Thử nghiệm tiến hành trên mơi trường Hugh-Leifson chứa chỉ thị pH là bromothymol blue
3. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate
Thử nghiệm dùng để xác định khả năng sử dụng citrat làm nguồn carbonhydrat duy nhất của vi sinh vật. Ở những chủng cĩ đặc tính này , sẽ cĩ khả năng dùng muối amoniu. Thử nghiệm được thực hiện trên mơi trường Simmon citrate cĩ nguồn carbon duy nhất là citrae với sự hiện diện của chất chỉ thị màu bromothymol blue.
4. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate
Thử nghiệm dùng để xác định khả năng sử dụng malonat làm nguồn carbon duy nhất. Ở những chủng cĩ đặc tính này, sẽ cĩ khả năng dùng muối amonium. Thử nghiệm được tiến hành trên mơi trường malonate broth với chất chỉ thị màu bromothymol blue.
5. Thử nghiệm catalase
Thử nghiệm dùng để phân biệt vi sinh vật hiếu khí và với sinh vật kỵ khí. Vi sinh vật hiếu khí cĩ enzym catalase, cĩ khả năng phân giải H2O2 (chất rất độc đối với tế bào) thành H2O và O2. Phản ứng được nhận diện nhờ sự sủi bọt của giọt H2O2 khi O2
bay lên.
Thử nghiệm dùng để phân loại và định danh các loại vi khuẩn đường ruột, dựa trên loại enzym decarboxylase xúc tác phản ứng phân giải một acid amin đặc trưng, tạo CO2 làm tăng pH mơi trường.
7. Thử nghiệm coagulase
Thử nghiệm thường dùng để định danh Staphylococcus. Lồi này cĩ khả năng tiết enzym coagulase cĩ tác dụng làm kết tụ các thành phần huyết tương, tạo khối đơng huyết tương.
8. Thử nghiệm urease
Thử nghiệm dùng để xác định khả năng tạo enzym urease của một số chủng vi sinh vật, nhất là nhĩm Proteus. Enzym này xúc tác phản ứng phân giải urê thành NH3
và CO2 làm tăng pH của mơi trường. 9. Thử nghiệm gelatinase
Thử nghiệm dùng để đánh giá khả năng tiết enzym gelatinase phân giải gelatine thành polypeptid và acid amin của các đối tượng vi sinh vật.
10. Thử nghiệm khả năng sinh H2S
Thử nghiệm dùng để xác định khả năng phân giải các acid amin chứa lưu huỳnh (cystein, cystin, methionin) sinh H2S nhờ enzym desulfuahydrase.
11. Thử nghiệm khả năng sinh idol
Thử nghiệm dùng để xác định khả năng chuyển hố các sản phẩm trung gian của quá trình oxy hố thành indol. Sản phẩm indol tạo thành được xác định nhờ phản ứng với thuốc thử p-dimethylaminobenzaldehide tạo phức hợp dạng qiunon cĩ màu đỏ.
12. Thử nghiệm KIA, TSI
Thử nghiệm KIA hay TSI là thử nghiệm được thực hiện đồng thời trên mơi trường KIA, TSI dùng để kiểm tra khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose, sucrose) và khả năng sinh H2S của vi sinh vật.
13. Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)
Thử nghiệm dùng để kiểm tra đặc tính sử dụng enzym nitratase để khử nitrat thành nitrite và các sản phẩm khác. Nitrite tạo thành sẽ được nhận biết nhờ phản ứng với sulphanilamide và N-napthylethylenediamide hydrochloride ở pH acid cho phức chất màu hồng.
14. Thử nghiệm oxidase
Thử nghiệm nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzym oxydase ở vi sinh vật. Hoạt tính oxydase được phát hiện nhờ thuốc thử p-phenylenediamin, nếu cĩ sự hiện của enzym, thuốc thử bị oxy hố một hợp chất indolphenol cĩ màu xanh dương.
15. Thử nghiệm ONPG
Thử nghiệm dùng để xác định hoạt tính enzym β-galactosidase tham gia vào quá trình lên men lactose ở vi sinh vật. Mơi trường thử nghiệm là ONPG broth chứa o- nitrophenyl-D-galactopyranoside. Sản phẩm tạo thành là o-nitrophenol cĩ màu vàng.
Thử nghiệm nhằm phân biệt vi sinh vật dựa vào sự khác biệt trong quá trình tạo và duy trì các sản phẩm cĩ tính acid từ sự lên men glucose. Vi sinh vật lên men glucose tạo và duy trì sản phẩm acid, làm đổi màu thuốc thử methy red trong mơi trường. Nếu sản phẩm acid tiếp tục biến đổi thành các sản phẩm trung tính, khơng làm đổi màu thuốc thử.
17. Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer)
Phản ứng dùng phân biệt các lồi trong họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, dựa vào sự oxi hố acetoin được tạo ra từ 2,3-butanediol thành diacetyl. Diacetyl được xác định dựa vào phản ứng kết hợp với nhân guanidine của pepton tạo phức đỏ.
18. Thử nghiệm CAMP
Phản ứng nhằm phân biệt các nhĩm Streptococcus. Phản ứng CAMP là thực hiện giữa nhân tố CAMP do Streptococcus nhĩm B tiết ra và β-hemolysin được tiết ra bởi Staphylococcus aureus làm tăng hoạt tính của β-hemolysin gây phá vỡ hồng cầu (tan huyết)
19. Thử nghiệm tính di động
Là thử nghiệm dùng để xác định đặc tính di động nhờ tiêm mao của vi sinh vật. Thử nghiệm được thực hiện trên mơi trường bán lỏng. Kết quả được xác định dựa vào kích thước của vệt cấy vi sinh vật.
Bộ KIT sinh hố định danh vi sinh vật
Ngày nay, các thử nghiệm sinh hố truyền thống để định danh vi sinh vật đã cĩ thể thực hiện ở các thuốc thử ở dạng đĩa giấy, que giấy. Ngồi ra, cịn cĩ các bộ KIT cho phép thực hiện hàng loạt thử nghiệm sinh hố theo một quy trình hai lựa chọn để định danh vi sinh vật. Các bộ KIT này được sản xuất dưới dạng thương phẩm cĩ ưu điểm là tiết kiệm thời gian, cơng sức; tuy nhiên cũng cĩ nhược điểm ví dụ như mỗi bộ KIT chỉ cho phép định danh một số vi sinh vật, chi phí thử nghiệm đắt tiền hơn
Hình 24. Các dạng KIT sinh hố định danh vi sinh vật
CHƯƠNG III