6.1.Nguyên tắc
Staphylococcus aureus là cầu khuẩn Gram dương, khơng sinh bào tử, khơng di động, thường tụ thành chùm cĩ khả năng lên men và sinh acid từ succrose, mannitol và sinh sắc tố vàng, chịu mặn (7,5% NaCl). và cĩ khả năng đơng tụ huyết tương (phản ứng coagulase (+)).
Staphylococcus aueus được xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng trên mơi trường Baird Parker Agar bằng kỹ thuật hộp trải và phản ứng làm đơng huyết tương. Dựa vào số khuẩn lạc đặc trưng cho phản ứng Coagulase (+) suy ra mật độ vi khuẩn này trong thực phẩm.
6.2.Dụng cụ, thiết bị, mơi trường và hĩa chất 6.2.1. Dụng cụ và thiết bị
Bảng 6.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 6
Dụng cụ Thiết bị
Phiến kính, lá kinh Tủ cấy vơ trùng
Đĩa petri (∅100 mm) Nồi hấp
Cốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấm
Đầu tip Pipetman (1000, 5000 µl) Pipetman (1000, 5000 µl)
Que trang Máy dập mẫu (Stomacher)
Kẹp inox Máy trộn mẫu (vortex mixer)
Đèn cồn Cân phân tích
Ống nghiệm
6.2.2. Mơi trường và hĩa chất
Bảng 6.2. Mơi trường và hĩa chất chỉ tiêu 6
Mơi trường Hĩa chất
Dung dịch Saline Peptone Water (SPW)
Cồn 90o và 70o
Môi trường Baird-Parker HCl 10%
Môi trường Trypticase Soy Agar NaOH 10%
(TSA)
Brain heart broth (BHI) KH2PO4
Huyết tương thỏ
6.3.Thực hành
6.3.1.Quy trình phân tích
6.3.2.Các bước tiến hành
Bước 1. Pha lỗng mẫu theo nồng độ pha lỗng thập phân: Cân/hút 10g/10ml mẫu thực phẩm đã được chuẩn bị vào chai/bình tam giác cĩ chứa sẵn 90ml dung dịch đệm, lắc đều mẫu 2-3 phút được nồng độ pha lỗng 10-1
Bước 2. Chuyển 1 ml dung dịch mẫu thử 10-1 sang ống nghiệm chứa sẵn 9 ml dung dịch đệm, lắc đều mẫu 2-3 phút được nồng độ pha lỗng 10-2. Tiếp tục làm tương tự, thu được mẫu thử tương ứng 10-3, 10-4....
Bước 3. Chuyển 0,1 ml dung dịch mẫu thử ở các nồng độ pha lỗng thu được vào chính giữa đĩa mơi trường BPA đã được chuẩn bị trước (bề mặt các đĩa mơi trường này khơng được ướt), dùng que trang trải đều mẫu trên mặt thạch. Cấy vào 2 đĩa mỗi nồng độ.
Lưu ý: Nếu số lượng Staphylococcus aureus dương tính thấp, cĩ thể nâng nồng độ dịch mẫu lên 10 lần, nghĩa là cấy 1ml dịch mẫu sơ khởi (mẫu nguyên nếu là
Mẫu thử đã pha lỗng (10-1, 10-2, 10-3...)
Chuy n 1ml dung d ch 10ể ị -1, 10-2, 10-3 vào ng 10ml ố
canh LBS, m i n ng đ 3 ng l p l i, 37ỗ ồ ộ ố ặ ạ ủ ở 0C, 48 giờ
Canh BHI/thạch TSA (37,0 ± 1,0oC, 24 giờ)
Baird-Parker (37,0 ± 1,0oC; 24 – 48 giờ)
Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng, 5 khuẩn lạc khơng đặc trưng
5
Phản ứng coagulase (37,0 ± 1,00C) (0,1ml dịch BHI; 0,3 ml huyết tương thỏ)
Đồng nhất mẫu 30 giây
Định lượng 10 g hoặc 10 ml mẫu thực phẩm
chất lỏng, hoặc mẫu 10-1 nếu là chất rắn) vào 3 đĩa. Kết quả ở 3 đĩa này được xử lý gộp như một đĩa khi đọc, khẳng định và báo cáo kết quả
Bước 4. Lật ngược các đĩa và ủ 37,0 ± 1,00C trong 24 ± 3 và 48 ± 4 giờ
Bước 5. Sau 24 ± 3 giờ, trên mơi trường thạch Bair parker khuẩn lạc Staphylococcus aureus dương tính cĩ đường kính 1-1,5mm, màu đen sáng, lồi. Mỗi khuẩn lạc cĩ quầng sáng rộng 1-2mm bao quanh. Những khuẩn lạc điển hình được đánh dấu trên mặt sau của đĩa và tiếp tục ủ thêm 24 giờ nữa. Sau 48 ± 4 giờ, khuẩn lạc Staphylococcus aureus dương tính cĩ đường kính 1,5-2,0mm, màu đen, sáng và lồi, quanh khuẩn lạc cĩ một vùng đục mờ hẹp, tiếp đĩ là vùng sáng, trong rộng 2-4 mm. Ngồi ra cịn cĩ các khuẩn lạc khơng tạo vầng sáng bao quanh, khơng tạo vùng đục sát khuẩn lạc, đĩ là các khuẩn lạc khơng điển hình. Các khuẩn lạc khơng điển hình này cũng được đánh dấu ở mặt sau của đĩa.
Bước 6. Cấy chuyển 5 khuẩn lạc điển hình và 5 khuẩn lạc khơng điển hình từ Baird Parker Agar sang ống nghiệm chứa 5 ml mơi trường BHI. Ủ 37,0 ± 1,0oC trong 24 ± 3 giờ.
Bước 7. Chuyển 0,1ml dịch nuơi cấy trong mơi trường BHI vào 0,3 ml huyết tương thỏ (hoặc theo hướng dẫn của nhà sản xuất) trong các ống nghiệm nhỏ đã tiệt trùng cĩ kích thước 10mm x 75mm, để tủ ấm 37,0 ± 1,0oC. Chú ý làm mẫu blank( mẫu chứng). Kiểm tra sự đơng vĩn của huyết tương sau 4, 6, 8, 24giờ. Phản ứng làm đơng tụ huyết tương được coi là dương tính khi thể tích đơng vĩn chiếm 3/4 tồn bộ thể tích chọn lựa
6.3.4.Kết quả
Mật độ Staphylococcus aureus trong 1g mẫu (CFU/g) =
21 1 ) ( 10 F F H N H Nt t a a + + × Trong đĩ:
- F1 và F2 : 2 độ pha lỗng liên tiếp
- Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng trên một đĩa ở các độ pha lỗng F1, F2
- Na: tổng số khuẩn lạc khơng đặc trưng trên một đĩa ở các độ pha lỗng F1, F2
- Ht: tỉ số giữa khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc đặc trưng
- Ha: tỉ số giữa khuẩn lạc khơng đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc khơng đặc trưng
6.4. Câu hỏi ơn tập
1. Tại sao phải bổ sung Egg Yolk Tellurite emulsion vào mơi trường BPA cơ bản?
2. Mơi trường BHI cĩ vai trị gì trong quy trình phân tích Staphylococcua aureus?
3. Hãy nêu hình thái khuẩn lạc đặc trưng của Staphylococcua aureus trên BPA. 4. Giải thích tại sao Staphylococcua aureus cĩ khả năng đơng tụ huyết tương thỏ