10.1.Nguyên tắc
Shigella là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí và kị khí tùy tiện, cho thử nghiệm catalase (+) (trừ Shigella dysenteriae), oxidase (-), lên men glucose khơng sinh hơi, hầu hết các lồi khơng lên men và tạo acid từ latose, dulcitol, khơng sinh H2S, khơng cĩ enzyme lysine decarboxylase.
Shigella cĩ thể được phát hiện bằng cách cấy một lượng mẫu xác định vào mơi trường lỏng khơng chọn lọc, sau đĩ được chuyển vào mơi trường tăng sinh chọn lọc. Dịch khuẩn sau khi tăng sinh chọn lọc được cấy phân lập trên ít nhất 2 loại mơi trường thạch đĩa với mức độ chọn lọc khác nhau. Khuẩn lạc nghi ngờ được kiểm tra bằng thử nghiệm sinh hĩa và kháng huyết thanh.
10.2.Dụng cụ, thiêt bị, mơi trường và hĩa chất 10.2.1.Dụng cụ và thiết bị
Bảng 10.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 10
Dụng cụ Thiết bị
Ống nghiệm Tủ cấy vơ trùng
Đĩa petri (∅100 mm) Nồi hấp
Cốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấm
Đầu tip Pipetman (1000, 5000 µl) Pipetman (1000, 5000 µl)
Que trang, que cấy vịng Máy dập mẫu (Stomacher)
Kẹp inox Máy trộn mẫu (vortex mixer)
Đèn cồn Cân phân tích
Pipette 1 ml, 10 ml Lị viba
10.2.2.Mơi trường và hĩa chất
Bảng 10.2.Mơi trường và hĩa chất chỉ tiêu 10
Mơi trường Hĩa chất
Dung dịch Trypton Soya (TSB) Cồn 90o và 70o
Canh Gram Negative (GN) Dd creatine 0,5 %
Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) KOH 40%
Mơi trường Hektoen Entric Agar (HE)
Deoxycholate Citrat Agar (DCA) HCl 10%
Thạch Mac Conkey (MAC) NaOH 10%
Môi trường Trypticase Soy Agar (TSA) Thuốc thử catalase
Môi trường Lysine Decacboxylase broth (LDC)
Que thử oxydase
Môi trường KIA hoặc TSI RSU
10.3.1.Quy trình phân tích
Chọn ít nhất 05 khuẩn lạc nghi ngờ cấy lên TSA , ủ 370C trong20-24giờ
Cấy 0,1 ml dịch tăng sinh sang 10 ml mơi trường GN, ủ
370C , 16 – 24 giờ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đồng nhất 25 g mẫu trong 225 ml TSB, ủ 370C , 16 – 24 giờ
Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 mơi trường chọn lọc phân biệt (T7A,MAC,XLD,HE,DC…), ủ 370C , 24 – 48giờ
Thử nghiệm sinh hĩa:
KIA/TSI : đỏ/vàng, H2S (-), gas (-) Khơng di động
Oxydase (-)
Thử nghiệm sinh hĩa khẳng định
10.3.2.Các bước tiến hành Bước 1. Tăng sinh
- Cân 25g mẫu đã nghiền, hoặc hút 25 ml mẫu cho vào bình đã chứa sẵn 225ml môi trường TSB, lắc đều , ủ 370C , 16 – 24 giờ
Bước 2. Tăng sinh chọn lọc
- Chuyển 0,1 ml dịch tăng sinh sang 10 ml canh tăng sinh GN, ủû 37oC trong 10-20 giờ.
Bước 3. Phân lập
- Dùng que cấy vòng cấy ria canh trường từ môi trường tăng sinh chọn lọc
lên đĩa petri chứa môi trường phân lập. Cần cấy thưa để tạo khuẩn lạc riêng biệt. Để ở 370C trong 24-48 giờ. Nên sử dụng ít nhất 2 mơi trường phân lập khác nhau.
Trên môi trường XLD, Shigella tạo các khuẩn lạc đỏ,trong suốt. Trên môi trường HE khuẩn lạc Shigella điển hình có màu xanh nhạt, trong suốt. Trên môi trường T7A khuẩn lạc Shigella điển hình có màu xanh nhạt (mơi trường đục như sữa, cĩ màu xanh hơi vàng nhạt). Trên môi trường MAC khuẩn lạc Shigella điển hình có màu đỏ nhạt (mơi trường cĩ màu đỏ cam, hơi đục)
Bước 4. Thử phản ứng sinh hĩa Thử nghiệm sàng lọc trên TSI/KIA): Mơi trường KIA được sử dụng để thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng sinh H2S.
Cấy đâm sâu phần cột thạch và cấy ria lên phần thạch nghiêng vi khuẩn từ những khuẩn lạc điển hình/nghi ngờ lên ống thạch nghiêng chứa môi trường KIAø. Ủ ở 370C trong 24 giờ.
Diễn giải sự biến đổi môi trường như sau:
Cột thạch:
- Màu vàng: glucose dương tính (lên men glucose)
- Màu đỏ hoặc không đổi màu: glucose âm tính (không lên men glucose) - Màu đen: có tạo thành sunfua hidro
- Có bọt khí hoặc có vết nứt : sinh khí từ glucose
Bề mặt thạch nghiêng:
- Màu vàng: lactose/saccharose dương tính (có sử dụng lactose/saccharose) - Màu đỏ hoặc không đổi màu: lactose/saccharose âm tính
1. Khơng cĩ VSV
2. Lên men lactose và glucose (mơi trường màu vàng)3. Sinh khí 3. Sinh khí
4. Chỉ lên men lactose (đỏ trên bề mặt, vàng ở dưới )5. Khử lưu huỳnh, sinh H2S (cĩ màu đen) 5. Khử lưu huỳnh, sinh H2S (cĩ màu đen)
Thử nghiệm khẳng định :
Các đặc trưng sinh hĩa củaShigella được tĩm tắt theo bảng :
Thử nghiệm sinh hĩa Kết quả Thử nghiệm sinh hĩa Kết quả
Simmon citrate - Saciline - (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Arginine decarboxylase - Xylose -
Lysine decarboxylase - Cellobiose -
Urea - Adonitol -
Malonate - Dulcitol -
MR + Inositol -
Thử nghiệm LDC
Lấy một que cấy đầy khuẩn lạc trên mơi trường TSA cấy ngay dưới bề mặt của mơi trường lỏng LDC, Ủ ở 370C trong 24 giờ
Trên môi trường LDC, Shigella phát triển sẽ làm đục và chuyển màu môi trường sang tím hay đỏ tía[LDC (+)], LDC (-) khi môi trường có màu vàng.
Thử nghiệm urea
Thực hiện trên mơi trường urea lỏng RSU chứa chỉ thị đỏ phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùng chuyển màu là pH 6,8 - 8,4). Cĩ thể sử dụng mơi trường urea thạch cơ bản cĩ bổ sung urea.
Lấy đầy một que cấy vịng từ khuẩn lạc trên mơi trường TSA vào ống chứa 3ml-5ml mơi trường RSU vơ trùng, lắc nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn và ủ ở 37oC trong 48 giờ.
Shigella khơng phân giải urea nên khơng làm thay đổi pH mơi trường; nếu phản ứng dương tính, việc phân giải ure sẽ giải phĩng NH3 làm đổi màu phenol red sang màu hoa hồng và sau đĩ chuyển sang màu đỏ tím.
Thử nghiệm VP
Hịa một vịng que cấy đầy từ khuẩn lạc trên mơi trường TSA vào các ống mơi trường MR-VP ủ ở 37oC trong 24 giờ.
Sau thời gian ủ, lấy 0,2 ml dịch cấy vào 01 ống nghiệm, thêm 02 giọt creatin, 06 giọt dung dịch 1- naphthol trong cồn, sau đĩ thêm 02 giọt KOH 40%, việc xuất hiện màu hồng đến màu đỏ tươi trong vịng 15 phút là phản ứng dương tính
Shigella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP, khơng đổi màu trên bề mặt mơi trường. Thử nghiệm VP (+) khi cĩ màu đỏ trên bề mặt mơi trường
10.3.4.Kết quả
Với quy trình kiểm nghiệm này cho phép kết luận cĩ hay khơng cĩ Shigella được phát hiện trong 25g mẫu
10.4.Câu hỏi ơn tập
1. Nêu các bước trong quy trình phân tích Shigella
2. Nêu hình thái các khuẩn lạc đặc trưng Shigella trên các mơi trương phân lập khác
VP (-) VP (+)
Hình 5.5. Thử nghiệmVP
Urea (-) Urea (+) Hình5.4. Thử nghiệm Urea