bào sinh học
Cỏc phương phỏp đỏnh giỏ độc tớnh của chất lỏng từ lờn cỏc dũng tế bào sinh học được thực hiện tại Bộ mụn Phụi và Tế bào thuộc Khoa Sinh trường Đại học Khoa học Tự nhiờn, Đại học Quốc gia Hà nội. Trong nghiờn cứu đỏnh giỏ độc tớnh của chất lỏng từ, chỳng tụi sử dụng phương phỏp Sulforhodamine-B (SRB) xỏc định protein tổng số với độ chớnh xỏc cao. SRB là một chất nhạy màu tan trong nước, ở dạng tinh thể cú màu tớm thẫm, khi tan trong dung mụi acid yếu cú màu tớm ỏnh hồng được dựng làm thuốc nhuộm tế bào [10]. SRB là thuốc nhuộm tớch điện õm sẽ liờn kết tĩnh điện được với cỏc phần tớch điện dương của protein. Lượng thuốc nhuộm liờn kết sẽ phản ỏnh lượng protein tổng của tế bào từ đú phản ỏnh số lượng tế bào và được xỏc định bằng cỏch đo mật độ quang học của dung dịch.
Cỏc mẫu chất lỏng từ: mẫu hạt nano Fe3O4 bọc tinh bột (SF) nồng độ lớn nhất 15 mg/ml; mẫu hạt nano từ bọc chitosan (Fe3O4-CS) nồng độ lớn nhất 10 mg/ml; mẫu hạt nano từ bọc chitosan biến tớnh (Fe3O4- OCMCS) nồng độ lớn nhất 2 mg/ml.
Doxorubicin: dạng dung dịch tiờm truyền cú hàm lượng 2mg doxorubicin hydrochloride trong 1ml NaCl 0,9% được dựng làm mẫu thuốc
đối chứng dương.
Cỏc tế bào thử nghiệm: tế bào ung thư cổ tử cung Hella 358, tế bào ung thư Sarcoma 180, tế bào lành biểu mụ thận chú MDCK.
Hỡnh thỏi cấu trỳc và kớch thước của tế bào được quan sỏt trờn kớnh hiểnvi quang học Axiovert 40CFL với thị kớnh 2xữ20x, vật kớnh 5xữ40x.
Cỏc bước tiến hành thử nghiệm độc tớnh
Nạp tế bào: tiến hành nạp tế bào vào trong cỏc giếng của đĩa nuụi cấy vi lượng 96 giếng (được bố trớ như 2.10) với nồng độ 104 tế bào/180 àl mụi trường nuụi cấy, sau đú nuụi trong điều kiện 37 oC, 5% CO2 cho tế bào ổn định trong 24 h.
Bảng 2. 4. Bố trớ thớ nghiệm trờn đĩa nuụi cấy 96 giếng.
Giỏ trị OD của VH Giỏ trị OD của mẫu chất lỏng từ Giỏ trị OD của Doxorobicin Tỷ số tăng sinh - - 100 - - 30 - - - - - 30 - - 10 - - - - - 10 - - 3 - - - - - 3 - - 1 - - - - - 1 - - 0.3 - - - - - 0.3 - - 0.1 - - - - - 0.1 - - 0.03 - - - - - 0.03 - - 0.01 - - -
VH là tế bào được nuụi cấy ở điều kiện mụi trường bỡnh thường khụng bổ xung thờm thành phần nào khỏc. Cỏc giếng cũn lại là tế bào nuụi trong mụi trường nuụi cấy cú bổ xung thờm cỏc vật liệu nano và thuốc đối chứng dương Doxorobicin ở cỏc nồng độ như sau: Cỏc giếng thớ nghiệm thử với cỏc chất lỏng từ cú thứ tự nồng độ Fe giảm dần tương ứng là 100 - 30 - 10 - 3 - 1 - 0.3
- 0.1 và 0.03àg/ml, cũn cỏc giếng ủ với thuốc đối chứng dương Doxorobicin cú nồng độ giảm dần lần lượt là 30 - 10 - 3 - 1- 0.3 - 0.1 - 0.03 và 0,01àg/ml. Mỗi nồng độ được tiến hành thớ nghiệm lặp lại 3 lần.
Ủ với chế phẩm kiểm tra độc tớnh: ủ tế bào ở mỗi giếng với 20àl chế phẩm đó pha trong 48h. Tại cựng thời điểm ủ với chế phẩm tiến hành cố định đĩa tế bào khỏc làm đối chứng (Tz).
Cố định tế bào bằng dung dịch TCA 50% (axit trichloroacetic), ủ 60 phỳt ở 4 oC. Sau đú rửa bằng nước để khụ ở nhiệt độ phũng.
Nhuộm với SRB: protein tổng số của cỏc tế bào sau khi cố định bằng TCA được nhuộm với dung dịch 0,4% SRB ở nhiệt độ phũng trong 10 phỳt. Lượng SRB dư thừa được rửa trụi bằng dung dịch 1% acetic acid, lặp lại 5 lần rồi để khụ ở nhiệt độ phũng.
Hũa tan thuốc nhuộm: Thuốc nhuộm bỏm vào protein được hũa tan bằng cỏch bổ sung dung dịch 10mM Tris Base và lắc nhẹ.Đo mật độ quang học của dung dịch SRB vừa được hũa tan trong cỏc giếng được xỏc định bằng mỏy Microplate Reader (SpectraMax 250) ở bước súng 540 nm.
Dựa vào giỏ trị mật độ quang học, ta xỏc định được % tỷ số tăng sinh (A%) của tế bào, từ đú đỏnh giỏ được độ độc đối với tế bào của chế phẩm. A được tớnh theo cụng thức: % z H z T T A V T (2. 9)
VH - Giỏ trị trung bỡnh của mật độ quang học ở cỏc giếng thử với dung mụi.
T - Giỏ trị trung bỡnh của mật độ quang học ở cỏc giếng thử với mẫu.
Tz - Giỏ trị trung bỡnh của mật độ quang học ở cỏc giếng nuụi TB ở thời điểm zero lỳc bắt đầu tra mẫu để thử).
Dựa vào giỏ trị A(%) ứng với dải nồng độ ta sẽ vẽ được đồ thị theo logarit và thu được phương trỡnh của A(%) (trục y) theo nồng độ (trục x): y = f(x) gọi là đường cong đỏp ứng liều. Khi y = 50% thỡ x = IC50 (Inhibited Concentration) là nồng độ gõy ức chế sự sinh trưởng 50%. Hầu hết cỏc nghiờn cứu độc tớnh của thuốc đối với tế bào đều sử dụng giỏ trị IC50 để đỏnh giỏ.
IC50 là giỏ trị tại 1 điểm trờn trục x tương ứng với giao điểm của đường thẳng P và
đường cong đỏp ứng liều
Nếu A = 50% tương đương với việc chế phẩm đem thử đó ức chế tăng sinh tế bào 50% so với đối chứng IC50%
(inhibitory concentration) Nếu A = 0% (T =Tz) tương đương với việc chế
phẩm đó ức chế toàn bộ quỏ trỡnh tăng sinh tế bào.
Nếu A < 0% (T < Tz) tương đương với việc chế phẩm thử gõy độc và làm chết tế bào. Liều mà tại đú giỏ trị A = -50% được gọi là liều gõy độc và làm chết 50% tế bào ban đầu, kớ hiệu là IC50% (cytotoxicity Index).
Quy trỡnh đỏnh gỏi độc tớnh của mẫu chất lỏng từ được đưa ra trong hỡnh 2.14.
Hỡnh 2.14. Quy trỡnh đỏnh giỏ độc tớnh của cỏc mẫu chất lỏng từ với cỏc dũng tế bào.
Hỡnh 2.13.Xỏc định giỏ trị IC50 trực tiếp dựa vào đồ thị đỏp ứng liều của cỏc dũng tế bào khi thử thuốc với cỏc nồng độ khỏc nhau.
A
(%
Kết luận chương 2
Trong chương này, chỳng tụi đó trỡnh bày cỏc phương phỏp thực nghiệm chế tạo mẫu vật liệu, đo đạc, phõn tớch cỏc đặc trưng và tớnh chất từ cũng như khả năng ứng dụng của cỏc hạt nano từ trong y sinh. Cỏc hạt nano Fe3O4 được chế tạo bằng phương phỏp đồng kết tủa và được bọc bằng cỏc polymer tương thớch sinh học như: tinh bột, chitosan và O-carboxymethylchitosan. Cỏc thiết bị sử dụng trong luận ỏn là cỏc thiết bị hiện đại cú độ chớnh xỏc và độ tin cậy cao. Đa số cỏc phộp đo đạc và phõn tớch được tiến hành trờn cỏc thiết bị tại Phũng Vật lý vật liệu Từ và Siờu dẫn, Phũng thớ nghiệm Trọng điểm Quốc gia thuộc Viện khoa học vật liệu. Ngoài ra chỳng tụi cũng thực hiện cỏc phộp đo đạc và nghiờn cứu tại cỏc cơ sở nghiờn cứu khỏc như: Đại học Khoa học tự nhiờn – Đại học Quốc gia Hà Nội, Đại học Bỏch khoa Hà Nội, ViệnHúa học – Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam. Cỏc kết quả thực nghiệm sẽ được phõn tớch và bàn luận trong cỏc chương 3 và chương 4.
Chương 3
TỔNG HỢP VÀ TÍNH CHẤT TỪ CỦA CÁC HẠT NANO Fe3O4 Cể