3. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
33.2.2. Phương pháp kiểm tra vi sinh vật có trong thịt
* Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong mẫu thịt
Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí (TCVN - 5667, 1992) [43]; lấy mẫu và chuẩn bị mẫu (TCVN - 4833 - 1 -ỉ- 2, 2002) [44].
-Nguyên lý: trên môi trường thạch thường, ở điều kiện hiếu khí, ở 37°c,
sau 24 giờ, mỗi khuẩn lạc phát triển riêng rẽ là một điểm xuất phát của vi khuẩn. Đếm số khuẩn lạc trên đĩa thạch chính là số vi khuẩn chứa trong mẫu phân tích.
(đã được hấp vô khuẩn, để nguội khoảng 45°C), trộn đều bằng cách xoay nhẹ đĩa 1 - 2 vòng theo chiều kim đồng hồ và ngược lại. Để đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng nằm ngang, sau đó lật ngược đĩa chuyển vào tủ ấm 37°c, trong 24 giờ đọc kết quả.
- Tính kết quả: đếm tất cả khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa thạch. Để tránh nhầm lẫn cần đưa đĩa thạch lên giá kính chia ô để đếm. Nếu vượt quá 300 khuẩn lạc /đĩa Petri thì loại bỏ và mẫu cần được pha loãng tiếp.
Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong lg thịt được tính theo công thức sau:
zc
N =---(W, +0.1W2)d (W, +0.1W2)d
Trong đó:
N: Số khuẩn lạc trong 1 gram mẫu kiểm tra, N biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 - 9,0 nhân với 10w (w là số mũ thích hợp của 10).
C: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn.
Wl, W2: Số đĩa ở 2 độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ nhất và thứ 2. d: Hệ số của đậm độ pha loãng đã chọn thứ nhất.
* Phương pháp xác định vi khuẩn E.coli trong 1 gram thịt
Xác định vi khuẩn E.coli (TCVN - 5155, 1990) [39]; lấy mẫu (TCVN - 5153, 1990) [38].
ria cấy chuyển sang môi trường thạch Endo để tủ ấm 42°c, 24 giờ, khuẩn lạc
E.coli có màu ánh kim.
Dùng hệ thống phản ứng IMVIC để định danh vi khuẩn:
+ Phản ứng đỏ Methyl: dương tính (M+), môi trường có màu đỏ. + Phản ứng Indol: (I+), môi trường có màu đỏ.
+ Phản ứng Simmons - Citrat: âm tính (C-).
+ Phản ứng Voges-prokauer: âm tính (V-), không màu, hoặc màu vàng. Kết quả thu được tính theo công thức sau:
1 1
X (vk/g) = Số khuẩn lạc đếm được X---X--- Khối lượng mẫu Bội số pha loãng
nuôi cấy mẫu thử * Phương pháp xác định vi khuẩn Salmonella có trong 25 gram thịt
Xác định vi khuẩn Salmonella (TCVN - 5153, 1990) [38]; FAO (1992) [59]. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu (TCVN - 4833 - 1-2, 2002) [44].
- Nuôi cấy tăng sinh: Cân 25g thịt (loại bỏ mỡ, gân, bạc nhạc) nghiền nhuyễn trong cối sứ, sau đó cho vào bình tam giác vô trùng có chứa 225 ml môi trường Selenit, để tủ ấm 37°c, 24 giờ.
- Phân lập trên môi trường chọn lọc: dùng que cấy vô trùng, ria cấy canh trùng từ môi trường tăng sinh sang môi trường thạch Brilliant green và
khuẩn Salmonella mặt nghiêng ống môi trường TSI có màu đỏ (nghĩa là không phân giải lactose và sucrose); thân và đáy có màu vàng, có bọt khí và vết nứt (phân giải glucose, sinh hơi); có màu đen (sinh PLS).
+ Nuôi cấy trên môi trường Ly sin decarboxylase: phản ứng dương tính có màu tím, âm tĩnh màu vàng.
+ Nuôi cấy trên môi trường urê (Christensen): cấy trên mặt nghiêng thạch, ủ 37°c, 24 giờ. Salmonella có phản ứng âm tính, môi trường không chuyển màu (dương tính màu đỏ).
+ Phản ứng Indol: nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường peptone, ủ 37°c, 24 - 48 giờ, sau đó nhỏ vào 1 ml thuốc thử, đọc kết quả. Salmonella có phản ứng âm tính, màu vàng nhạt; dương tính màu đỏ.
+ Phản ứng VP ( Voges-Proskauer): cấy vi khuẩn vào môi trường peptone glucose, ủ 37°c, 48 giờ. Chuyển 1 ml canh trùng vào một ống nghiệm khác, bổ sung 0,6 ml dung dịch cồn Anpha naptol và 0,2 ml Kalihydroxyt 40%, lắc và đọc kết quả sau 5 - 1 5 phút. Salmonella có phản ứng âm tính không màu hoặc vàng nhạt; dương tính màu đỏ.
+ Phản ứng (3 - Galactosidase (O.N.P.G): nhỏ 1 giọt Toluen vào ống nghiệm chứa hỗn dịch 0,25 ml nước muối đẳng trương với khuẩn lạc, lắc đều, ủ cách thuỷ 37°c, 15 phút; nhỏ tiếp 0,25 ml thuốc thử lắc đều, ủ cách thuỷ 37°c, 24 giờ. Salmonella phản ứng âm tĩnh không chuyển màu, dương tính màu vàng.
Huyết tương đông cứng sau 4-6 giờ khó di động
4(+) Xác định là
Staphylococcus
Huyết tương đông chắc sau 6 giờ dễ di
3(+)
Không được xem là
Staphylococcus aureus
Huyết tương đông thành cục nhỏ sau 24 giờ
2 ( + )
Không được xem là
Staphylococcus aureus
Huyết tương đông thành cục nhỏ không liên kết thành khối
1 (+) Không được xem là
Staphylococcus Việt Yên 01 40 0 24 20 85 42,5 TP. Bắc Giang 0 41 0 20 02 63 31,5 0 Lạng Giang 0 39 01 12 0 52 26,0 0 Tổng 01 120 01 56 22 20 100,00
- Chuẩn bị mẫu: cân 25 g mẫu cho vào bình hoá lỏng vô trùng, thêm 225 ml dung dịch pha loãng pepton, trộn đều trong 1 - 2 phút ở tốc độ 10.000 - 12.000 vòng/ phút. Sử dụng dung dịch pha loãng liên tục từ 10'6 - 10'7 bằng cách di chuyển liên tục 10 ml của dung dịch pha loãng trước vào bình chứa 90 ml pepton.
- Phương pháp nuôi cấy: lấy 1 ml dung dịch pha loãng ở mỗi đậm độ cần kiểm tra cho vào trung tâm đĩa thạch Baird parker đã được hong khô, xoay và nghiêng đều về các phía để dung dịch đều trên mặt thạch, lật úp đĩa thạch, để vào tủ ấm 37°c ± l°c, trong 24 - 48 giờ.. Mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa thạch.
Sau đó lựa chọn các đĩa thạch có từ 30 - 300 khuẩn lạc màu đen, lồi, tròn, bờ đều, bang, có vòng trong suốt ở xung quanh. Sử dụng máy đếm khuẩn lạc đế đếm số khuẩn lạc nghi ngờ.
- Giám định Staphylococcus aureus bằng cách thực hiện các phép thử kiểm tra đặc tĩnh làm đông huyết tương của vi khuẩn.
+ Phản ứng đông vón trên phiến kính: nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý lên phiến kính, dùng que cấy lấy vi khuẩn vừa đủ trộn thành huyễn dịch đục đều, nhỏ tiếp 1 giọt huyết tương vào (thí nghiệm đối chứng 1 giọt nước muối sinh lý, 1 giọt huyết tương), sau đó đọc kết quả quan sát khả năng đông huyết tương trên phiến kính bằng kính hiển vi.
+ Phản ứng đông vón trong ống nghiệm: chọn mỗi loại 5 khuẩn lạc nghi
1
Kết quả thu được tính theo công thức sau: 1
X (vk/g) = Số khuẩn lạc đếm được X---X
Khối lượng mẫu Bội số pha loãng