II. Monoester alc.
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.2.2.4. Định lượng aconitin.
* Mẫu nghiên cứu: Phụ tử sống, Hắc phụ, Bạch phụ, cao Phụ tử.
* Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Triển khai trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Merk-Hitachi D7000 tại phòng Kiểm tra chất lượng, Công ty cổ phần Traphaco.
* Điều kiện sắc ký:
+ Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phòng thí nghiệm (25 ± 5°C). + Detector UV 230nm.
+ Tốc độ dòng: 0,8ml/phút. + Thể tích tiêm sắc ký: 20µl
+ Pha động: Lọc và đuổi khí dung dịch methanol – nước – cloroform – triethylamin (66: 32: 2: 0,1)
+ Chất chuẩn: Aconitin
* Phương pháp xử lý mẫu (các dung dịch tiêm sắc ký):
- Chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 5g bột Phụ tử sống, 10g bột Phụ tử chế hoặc lượng cao tương đương với 10g dược liệu, cho vào bình nón nút mài, thêm 50ml ether và 4 ml amoniac, đậy kín, lắc kỹ, để qua
đêm, lọc. Bã còn lại đem lắc với 50 ml ether liên tục trong 1giờ, lọc. Rửa bã 3 lần bằng ether, mỗi lần 15ml, lọc. Gộp dịch lọc và dịch rửa, đun cho bay hơi ở
nhiệt độ thấp (khoảng 60-65°C) đến khô. Cắn được hoà tan với 2ml cloroform, tráng rửa bình đựng cắn 3 lần, mỗi lần 3 ml cloroform. Gộp dịch cloroform vào bình gạn. Chiết với dung dịch H2SO4 0,1N 3 lần, mỗi lần 5ml. Gộp dịch acid, rửa bằng 10 ml cloroform, điều chỉnh pH đến 9 bằng dung dịch amoniac. Chiết bằng cloroform 3 lần, mỗi lần 10ml. Gộp dịch cloroform, rửa bằng 20ml nước cất. Thu lớp dịch cloroform, làm bay hơi ở nhiệt độ thấp
đến khô. Cắn được hoà tan trong ethanol khan và chuyển vào bình định mức 5ml, thêm ethanol vừa đủ, lắc đều. Lấy 1ml pha loãng với pha động cho vừa
đủ 5 ml, lọc qua màng lọc 0,45µm.
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 10mg aconitin vào bình định mức 50ml, thêm ethanol khan để hoà tan và bổ sung vừa đủđến 50 ml. Lấy chính xác 1ml dung dịch pha loãng với pha động đến vừa đủ 10ml. Lọc qua màng lọc 0,45µm.
Tiến hành sắc ký, ghi lại sắc ký đồ. Từ diện tích pic của aconitin chuẩn và thử tính ra hàm lượng của aconitin (tính trên mẫu khô tuyệt đối).