II. Monoester alc.
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.2.2.3. Định lượng diester alcaloid
* Mẫu nghiên cứu: Phụ tử sống, Hắc phụ, Bạch phụ, cao Phụ tử.
* Phương pháp đo độ hấp thụ tử ngoại – khả kiến (theo DĐTQ 2005).
Đo trên máy quang phổ tử ngoại - khả kiến U-2010 (Hitachi) - Nhật Bản tại phòng Kiểm tra chất lượng, Công ty cổ phần Traphaco.
* Chất chuẩn: Aconitin của hãng Latoxan - Pháp.
* Xây dựng đường cong chuẩn:
+ Pha dung dịch chuẩn aconitin:
Cân chính xác khoảng 20 mg aconitin vào bình định mức 10 ml, thêm
ethanol khan để hoà tan và bổ sung vừa đủđến 10 ml. + Lập đường cong chuẩn:
Cho chính xác 0ml; 0,25ml; 0,50ml; 1,0ml; 1,5ml; 2,0ml; 2,5ml dung dịch chuẩn aconitin lần lượt vào 6 bình định mức 25ml, thêm ethanol khan lần lượt vào 7 bình định mức trên vừa đủ 2,5ml. Pha thêm 2 dung dịch aconitin trong ethanol khan (2,5ml) có nồng độ gấp 2 và 4 lần nồng độ dung dịch
chuẩn trên cho vào 2 bình định mức 25ml. Thêm chính xác 1,5ml dung dịch
hydroxylamin hydrochlorid kiềm vào từng bình định mức, lắc đều, bảo ôn 10 phút trong nước ở nhiệt độ 60 – 650C, để nguội, thêm 13ml dung dịch sắt perclorat, lắc đều, để yên 5 phút, cho thêm chính xác 8ml dung dịch acid percloric, hoà loãng đến vạch bằng dung dịch sắt perclorat, lắc đều, để yên 15 phút, đo độ hấp thụở bước sóng 520 nm, lập đường cong chuẩn.
* Định lượng diester alcaloid:
Cân chính xác khoảng 5g bột Phụ tử sống, 10g bột Phụ tử chế hoặc lượng cao tương đương với 10g dược liệu, cho vào bình nón nút mài, thêm 50ml ether và 4 ml amoniac, đậy kín, lắc kỹ, để qua đêm, lọc. Bã còn lại đem
lắc với 50 ml ether liên tục trong 1giờ, lọc. Rửa bã 3 lần bằng ether, mỗi lần 15ml, lọc. Gộp dịch lọc và dịch rửa, đun cho bay hơi ở nhiệt độ thấp (khoảng 60-65°C) đến khô. Cắn được hoà tan với 2ml cloroform, tráng rửa bình đựng cắn 3 lần, mỗi lần 3 ml cloroform. Gộp dịch cloroform vào bình gạn. Chiết với dung dịch H2SO4 0,1N 3 lần, mỗi lần 5ml. Gộp dịch acid, rửa bằng 10 ml cloroform, điều chỉnh pH đến 9 bằng dung dịch amoniac. Chiết bằng cloroform 3 lần, mỗi lần 10 ml. Gộp dịch cloroform, rửa bằng 20 ml nước cất. Thu lớp dịch cloroform, làm bay hơi ở nhiệt độ thấp đến khô. Cắn được hoà tan trong ethanol khan và chuyển vào bình định mức 5ml, thêm ethanol vừa
đủ, lắc đều, được dung dịch A.
Lấy chính xác 2,5ml dung dịch A cho vào bình định mức 25ml và
2,5ml ethanol khan vào bình khác để làm mẫu trắng. Thêm chính xác 1,5ml
dung dịch hydroxylamin hydroclorid kiềm vào từng bình định mức, lắc đều, bảo ôn trong nước ở nhiệt độ 60-65°C, để nguội. Thêm 13ml dung dịch sắt
perclorat, lắc đều, để yên 5 phút. Thêm chính xác 8ml dung dịch acid
percloric, hoà loãng đến vạch bằng dung dịch sắt perclorat, lắc đều, để yên 15 phút, được dung dịch B.
Đo độ hấp thụ dung dịch B ở bước sóng 520nm. Dựa vào đường cong chuẩn xác định được nồng độ diester alcaloid tính theo aconitin (µg/ml), từđó tính được hàm lượng diester alcaloid trong các mẫu nghiên cứu theo aconitin (tính trên mẫu khô tuyệt đối).