Quá trình phân lập và ựịnh tên các chủng nấm mốc xanh từ các mẫu quả cam hỏng ựược tiến hành như sau:
Sơ ựồ 3.1: Quy trình phân lập, ựịnh tên các chủng nấm mốc xanh từ quả cam bị thối hỏng
Cam hỏng
Phân lập nấm gây bệnh
Làm sạch
định tên dựa vào ựặc ựiểm hình thái Còn một loại
a) Tiến hành phân lập
Theo thủ tục vô trùng, lấy 10 g mẫu quả cam thối hỏng cho vào bình tam giác 250 ml ựã có sẵn 90 ml nước vô trùng ựặt lên máy lắc trong vòng 20 phút. Dùng một loạt ống nghiệm, mỗi ống chứa 9 ml nước vô trùng có pha thêm 0,1% thạch ựể pha loãng (bằng cách này sẽ rửa ựược hết ựược bào tử ựắnh ở trên mẫu và do dịch pha có tắnh chất keo nên bào tử phân tán ựược ựều hơn). Dịch mẫu ựược pha loãng bậc 10 thành dãy pha loãng. Mỗi ựộ pha loãng ựược cấy gạt vào ắt nhất 3 hộp peptri chứa môi trường PSA và nuôi cấy ở 30 - 350C, trong 3 - 5 ngày. Sau khi nấm mốc ựã mọc thành khuẩn lạc riêng rẽ, tách thuần khiết riêng từng loại và cấy sang ống thạch nghiêng ựể tiếp tục những nghiên cứu khác.
để phân loại thuần chủng, dùng que cấy vô trùng nhỳng vào ống nước vô trùng, chấm từng loại khuẩn lạc ựã mọc tốt trong ựĩa peptri (phân biệt bằng quan sát ựại thể) sao cho không bị lẫn các loại bào tử khác nhau (của những khuẩn lạc khác loại), sau ựó cấy ba chấm vào các ống thạch nghiêng chứa các môi trường trên. Tiếp tục nuôi trong tủ ấm 3 - 5 ngày sẽ thu ựược các ống nghiệm mà mỗi ống chỉ chứa một loại khuẩn lạc nhất ựịnh. Giữ các ống trong tủ lạnh 40C ựể phân loại dần.
b) định tên nấm mốc Penicillium chắnh
Chuẩn bị môi trường thạch ựĩa: Pha môi trường nói trên vào các bình tam giác. Khử trùng bằng autoclave ở nhiệt ựộ 1210C, thời gian 30 phút. Làm nguội tới 40 - 450C, phân phối vào các ựĩa peptri vô trùng và sấy khô mặt thạch.
Khi phân loại dùng que cấy vô trùng lấy nấm từ những ống nghiệm ựã ựược phân lập thuần chủng ra ựĩa peptri. Khi cấy xong, úp ựĩa ựể các bào tử không rơi ra môi trường xung quanh.
Nuôi ở nhiệt ựộ và ựộ ẩm thắch hợp (nhiệt ựộ 30 - 350C, ựộ ẩm 80 - 85%), sau 3 - 5 ngày quan sát ựại thể và xem khuẩn lạc ở vật kắnh nhỏ ựể thấy những ựặc ựiểm hình thái chung. Khi quan sát phần ựại thể chú ý những ựặc ựiểm sau:
- Màu sắc và sự thay ựổi màu sắc của khuẩn lạc
- Hình thái mặt trái của khuẩn lạc (màu sắc, hình dạng các nếp nhăn). - Màu sắc của môi trường (sắc tố khuếch tán hay không khuếch tán). - Hình thái khuẩn ty (thưa, dày, mịn, xốp, ựồng ựều hay có từng cụm nhô lên). - Sự tạo mùi vị ựặc biệt.
- Sự tạo thành các giọt nước ựọng trên bề mặt khuẩn lạc.
Tùy loài phát triển nhanh chậm mà 7 - 10 ngày hoặc 15 ngày sau quan sát lại làm tiêu bản vi thể xem chi tiết các cơ quan sinh sản: cuống sinh bào tử, bào tử ựắnh, kết cấu hình thái bào tử. Sau cùng ựối chiếu với khóa phân loại Bùi Xuân đồng.