3.1.1. Nguyên vật liệu
Quả cam Valencia trồng tại huyện Cao Phong tỉnh Hòa Bình.
Quả ựược thu hoạch tại vườn bằng kéo, sau ựó ựược xếp trong các thùng giấy ựược vận chuyển bằng ô tô. Thời gian từ khi thu hái ựến khi làm thắ nghiệm không quá 24 giờ. Và thu hái nguyên liệu khi vỏ quả của nguyên liệu có màu xanh vàng
Quả cam Trung Quốc ựược mua tại chợ trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội, quả tươi, nguyên vẹn và không bị tổn thương cơ giới .
- Hóa chất :
- Cồn etanol sạch 96%, 70%. Và ựược sản xuất tại Việt Nam
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Môi trường PSA (Potato Sugar Agar) - Khoai tây : 200 gam
- Saccharose : 20 gam - Agar : 20 gam - Nước : 1000ml
3.1.2. địa ựiểm
địa ựiểm thắ nghiệm ựược thực hiện tại phòng thắ nghiệm của khoa Công nghệ Thực phẩm, Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội.
3.2. Nội dung nghiên cứu:
1. Phân lập, ựịnh tên nấm mốc xanh trên quả cam bị thối hỏng sau thu hoạch
2. Nghiên cứu ảnh hưởng của etanol ựến sự phát triển của nấm mốc xanh gây hư hỏng cho cam sau thu hoạch trên môi trường PSA
3. Nghiên cứu khả năng ứng dụng etanol ựể bảo quản cam sau thu hoạch
3.3. Phương pháp nghiên cứu:
3.3.1. Phân lập nấm mốc xanh từ quả cam bị thối hỏng
Quá trình phân lập và ựịnh tên các chủng nấm mốc xanh từ các mẫu quả cam hỏng ựược tiến hành như sau:
Sơ ựồ 3.1: Quy trình phân lập, ựịnh tên các chủng nấm mốc xanh từ quả cam bị thối hỏng
Cam hỏng
Phân lập nấm gây bệnh
Làm sạch
định tên dựa vào ựặc ựiểm hình thái Còn một loại
a) Tiến hành phân lập
Theo thủ tục vô trùng, lấy 10 g mẫu quả cam thối hỏng cho vào bình tam giác 250 ml ựã có sẵn 90 ml nước vô trùng ựặt lên máy lắc trong vòng 20 phút. Dùng một loạt ống nghiệm, mỗi ống chứa 9 ml nước vô trùng có pha thêm 0,1% thạch ựể pha loãng (bằng cách này sẽ rửa ựược hết ựược bào tử ựắnh ở trên mẫu và do dịch pha có tắnh chất keo nên bào tử phân tán ựược ựều hơn). Dịch mẫu ựược pha loãng bậc 10 thành dãy pha loãng. Mỗi ựộ pha loãng ựược cấy gạt vào ắt nhất 3 hộp peptri chứa môi trường PSA và nuôi cấy ở 30 - 350C, trong 3 - 5 ngày. Sau khi nấm mốc ựã mọc thành khuẩn lạc riêng rẽ, tách thuần khiết riêng từng loại và cấy sang ống thạch nghiêng ựể tiếp tục những nghiên cứu khác.
để phân loại thuần chủng, dùng que cấy vô trùng nhỳng vào ống nước vô trùng, chấm từng loại khuẩn lạc ựã mọc tốt trong ựĩa peptri (phân biệt bằng quan sát ựại thể) sao cho không bị lẫn các loại bào tử khác nhau (của những khuẩn lạc khác loại), sau ựó cấy ba chấm vào các ống thạch nghiêng chứa các môi trường trên. Tiếp tục nuôi trong tủ ấm 3 - 5 ngày sẽ thu ựược các ống nghiệm mà mỗi ống chỉ chứa một loại khuẩn lạc nhất ựịnh. Giữ các ống trong tủ lạnh 40C ựể phân loại dần.
b) định tên nấm mốc Penicillium chắnh
Chuẩn bị môi trường thạch ựĩa: Pha môi trường nói trên vào các bình tam giác. Khử trùng bằng autoclave ở nhiệt ựộ 1210C, thời gian 30 phút. Làm nguội tới 40 - 450C, phân phối vào các ựĩa peptri vô trùng và sấy khô mặt thạch.
Khi phân loại dùng que cấy vô trùng lấy nấm từ những ống nghiệm ựã ựược phân lập thuần chủng ra ựĩa peptri. Khi cấy xong, úp ựĩa ựể các bào tử không rơi ra môi trường xung quanh.
Nuôi ở nhiệt ựộ và ựộ ẩm thắch hợp (nhiệt ựộ 30 - 350C, ựộ ẩm 80 - 85%), sau 3 - 5 ngày quan sát ựại thể và xem khuẩn lạc ở vật kắnh nhỏ ựể thấy những ựặc ựiểm hình thái chung. Khi quan sát phần ựại thể chú ý những ựặc ựiểm sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Màu sắc và sự thay ựổi màu sắc của khuẩn lạc
- Hình thái mặt trái của khuẩn lạc (màu sắc, hình dạng các nếp nhăn). - Màu sắc của môi trường (sắc tố khuếch tán hay không khuếch tán). - Hình thái khuẩn ty (thưa, dày, mịn, xốp, ựồng ựều hay có từng cụm nhô lên). - Sự tạo mùi vị ựặc biệt.
- Sự tạo thành các giọt nước ựọng trên bề mặt khuẩn lạc.
Tùy loài phát triển nhanh chậm mà 7 - 10 ngày hoặc 15 ngày sau quan sát lại làm tiêu bản vi thể xem chi tiết các cơ quan sinh sản: cuống sinh bào tử, bào tử ựắnh, kết cấu hình thái bào tử. Sau cùng ựối chiếu với khóa phân loại Bùi Xuân đồng.
3.3.2. Bố trắ thắ nghiệm
3.3.2.1. Thắ nghiệm 1: Ảnh hưởng của Etanol ựến sự phát triển của nấm mốc
trên môi trường PSA:
được bố trắ ngẫu nhiên vào 4 công thức thắ nghiệm
CT1: Môi trường PSA có bổ sung 1% nồng ựộ Etanol CT1: Môi trường PSA có bổ sung 3% nồng ựộ Etanol CT1: Môi trường PSA có bổ sung 5% nồng ựộ Etanol
CT1: Môi trường PSA không bổ sung nồng ựộ Etanol dùng làm mẫu ựối chứng với các công thức trên
3.3.2.2. Thắ nghiệm 2: Nghiên cứu khả năng sử dụng Etanol và bao bì trong bảo quản cam sau thu hoạch:
được bố trắ ngẫu nhiên vào 8 công thức thắ nghiệm
CT1: Quả ựược rửa nước máy và bao gói bằng túi PE 0.03 mm
CT2: Quả không ựược rửa nước máy và bao gói bằng túi PE 0.03 mm. CT3: Quả ựược rửa nước máy và bao gói bằng túi PE 0.03 mm có ựục lỗ 5% CT4: Quả cam ựược rửa bằng nước máy, không phun etanol 70%, ựược bao gói bằng bao bì carton
CT5: Quả cam ựược rửa bằng nước máy, phun etanol 70% ướt ựều trên bề mặt quả 1 lần trước khi bảo quản, ựược bao gói bằng bao bì carton
CT6: Quả cam ựược rửa bằng nước máy, phun etanol 70% ướt ựềutrên bề mặt quả 7 ngày/ 1 lần, ựược bao gói bằng bao bì carton
CT7: Quả cam không ựược rửa bằng nước máy, không phun etanol 70%, ựược bao gói bằng bao bì carton
CT8: Cam Trung Quốc, không ựược rửa bằng nước máy, không phun etanol, ựược bao gói bằng bao bì carton dùng làm mẫu sao sánh với các công thức trên
3.3.3.Phương pháp xác ựịnh các chỉ tiêu theo dõi chất lượng quả cam trong quá trình bảo quản. quá trình bảo quản.
a. Phương pháp xác ựịnh chỉ tiêu vật lý
1. Kắch thước trung bình (mm): ựược xác ựịnh bằng thước Palme ựiện tử (ổ0.01mm).
2. Khối lượng trung bình (g):
được xác ựịnh bằng cân kỹ thuật (ổ0.01). 3. Màu sắc:
Xác ựịnh bằng máy ựo màu cầm tay Color Meter (Tec PCM/PSM, Mỹ) ựược xác ựịnh thông qua các chỉ số L, a, b hiện ra trên máy:
L: ựặc trưng cho ựộ sáng của vỏ quả có trị số từ 0(ựen) ựến 100(trắng). a: ựặc trưng cho màu sắc có giá trị từ -60(xanh lá cây) ựến +60 (ựỏ). b: ựặc trưng cho màu sắc có giá trị từ -60 (xanh lam) ựến +60 (vàng). 1. độ cứng:(kg/cm2)
Xác ựịnh bằng máy ựo ựộ cứng quả Penetrometer Fruit pressure tester. Mod. FT 327 của Cộng Hòa Liên Bang đức. Dựa trên nguyên lý ựo ựộ lún dưới tác dụng của một lực theo phương nằm ngang ở 2 vị trắ (vị trắ gần cuống quả và vị trắ giữa quả) với ựường kắnh ựầu ựo là 5mm.
X=(M1-M2)x100/M1
Trong ựó: X: Hao hụt khối lượng tự nhiên ở mỗi lần phân tắch (%) M1: Khối lương quả trước khi bảo quản (g)
M2: Khối lượng quả ở các lần phân tắch (g)
1. Tỉ lệ hư hỏng (%) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
F=Hn x100/H Trong ựó: F: Tỉ lệ hư hỏng (%)
Hn: Số quả bị hư hỏng ở các lần phân tắch (n= 1, 2, 3,Ầ). H: Số quả lúc ựầu trong mẫu thắ nghiệm.
b. Phương pháp xác ựịnh chỉ tiêu hóa học chắnh - Hàm lượng chất khô tổng số
Cân 10-15g mẫu nghiền nhỏ cho vào cốc sấy, sấy ựến khối lượng không ựổi ở nhiệt ựộ 100-1050C, cân khối lượng còn lại sau khi sấy. Tắnh hàm lượng chất khô theo công thức:
Hàm lượng chất khô tổng số(%)= − ừ100
A C B
Trong ựó:
A: Khối lượng mẫu ựem sấy (g)
B: Khối lượng mẫu + cốc sấy sau khi sâý (g) C: Khối lượng cốc sấy (g)
2. Acid hữu cơ tổng số
Nguyên lý: Acid hữu cơ dễ dàng hòa tan trong nước. nước chiết rút ựược chuẩn ựộ bằng NaOH 0,1 N, qua ựó ta có thể tắnh ựược lượng acid hữu cơ trong mẫu.
Kết quả:
X= a. 0,007.V.T.100/v.c Trong ựó:
a: Số ml NaOH 0,1 N cần ựể chuẩn ựộ
acid citric, nhưng lượng acid tổng số cũng tắnh theo hệ số này bởi vì acid citric có nhiều trong cam)
T: Hệ số ựiều chỉnh ựối với NaOH 0,1 N V: Tổng thể tắch dung dịch chiết
v: Số ml dung dịch lấy ựể chuẩn ựộ c: Khối lượng mẫu (g)
3. Trạng thái quả:
Trong quá bảo quản chúng tôi theo dõi sự thay ựổi về hình thức bề ngoài của quả dựa trên thang ựo trạng thái quả mà chúng tôi ựã xây dựng ở dưới:
Bảng 3.1: đánh giá trạng thái quả
Trạng
thái quả Kắ hiệu Mô tả
Tươi + Vỏ quả căng, nhẵn bóng, màu vàng xanh ựặc trưng, bề mặt vỏ xung quanh cuống phẳng
Hơi héo ++ Vỏ quả không căng, ắt bóng, màu vàng chiếm ựa số, bề mặt vỏ xung quanh cuống hơi nhăn
Héo +++ Vỏ quả nhăn nheo, hơi sần, màu vàng héo, bề mặt vỏ xung quanh cuống nhăn nheo.
3.3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thắ nghiệm ựược xử lý bằng chương trình SPSS 16.0 và Excel 2007 trong window
PHẦN THỨ TƯ
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.1. Thu thập mẫu bệnh
Chúng tôi tiến hành thu thập mẫu bệnh từ các quả cam hỏng. Việc phát hiện quả bị bệnh sớm là một việc làm rất quan trọng vì khi ựó mẫu bệnh ắt bị nhiễm khuẩn ty, vi khuẩn hay nấm men do ựó thuận lợi hơn trong công tác phân lập và xác ựịnh nấm gây bệnh chắnh trên quả sau thu hoạch.
4.2. Phân lập nấm trên mẫu bệnh ựiển hình thu ựược từ các quả hư hỏng
Mẫu bệnh ựược chọn lựa và rửa sạch bằng nước (sử dụng vòi nước chảy), quả ựược thấm khô bằng giấy thấm. Thực hiện thao tác phân lập và nuôi cấy như quy trình ựã nêu ở phần ba, mục 3.3.
Kết quả phân lập cho thấy, trên các mẫu quả bệnh thu ựược trong quá trình bảo quản có sự xuất hiện chủ yếu của 2 loài nấm và chúng tôi nghi ngờ ựó là loài Penicillium. Hai loài này chúng tôi lần lượt ký hiệu là TQ1 và TQ2
Ngoài hai chủng nấm mốc xuất hiện chắnh trên quả Cam chúng tôi còn phân lập thêm ựược một số chủng nấm mốc khác nhưng tỉ lệ xuất hiện là thấp hơn trên các quả Cam trong quá trình bảo quản. Các loại nấm mốc này có hình ảnh khuẩn lạc ựược miêu tả trong hình 4.1.
đ2 đ1
V1 X1
Hình 4.1: đặc ựiểm của khuẩn lạc nấm đ1, đ2, X1, V1 , nuôi trên môi trường PSA ở ựiều kiện nhiệt ựộ 30oC và hoạt ựộ nước là 0.99.
đặc ựiểm hình thái khuẩn lạc của các loại nấm mốc
Qua kết quả trên có thể thấy sự ựang dạng của các loại nấm sợi nhiễm tạp trên quả Cam. Vì vậy bước tiếp theo của nghiên cứu chúng tôi tiến hành xác ựịnh ựặc ựiểm hình thái, kắch thước của khuẩn lạc. Thắ nghiệm ựược thực hiện trên môi trường ựặc trưng cho các loại nấm mốc là PSA. Các chủng nấm sợi ựược tiến hành nuôi cấy ở nhiệt ựộ 300C và sau 72h nuôi cấy, kết quả trình bày ở bảng
Bảng 4.1: đặc ựiểm bề mặt, kắch thước khuẩn lạc các chủng nấm sợi T T Kắ hiệu Màu sắc Hình thái khuẩn lạc Bề mặt Kắch thước (mm) 1 đ1 đen vàng, xung quanh khuẩn lạc là hệ sợi nấm có màu trắng Tròn, có nhân, viền trắng
Hệ sợi lan tỏa
rộng 15
2 đ2
Nấm sợi sinh bào tử nên ở giữa khuẩn lạc có màu ựen ánh, hệ sợ nấm lan tỏa
Tỏa tròn Giữa hơi lồi,
nhăn giữa 17
3 X1
Nấm bắt ựầu sinh bào tử nên ở giữa khuẩn lạc có màu xanh lục, xung quanh khuẩn lạc có màu trắng, ở ngoài cùng khuẩn lạc có các sợi nấm không màu
Tỏa tròn Lồi ở tâm, tạo thành khắa 25 4 V1 Vàng tươi Tỏa tròn, có
nhân Hơi lồi 20
5 TQ1
Khuẩn lạc có màu xanh lục chiếm ưu thế hơn, các sợi nấm màu trắng và không màu ở ngoài cùng
Tỏa tròn 50
6 TQ2
Có màu xanh ở giữa và xung quanh là màu trắng
Qua kết quả nghiên cứu trên và so sánh với ựặc ựiểm hình thái khuẩn lạc theo Samson và cs 1995, chúng tôi có thể sơ bộ xác ựịnh ựược 02 loài nấm gây bệnh chắnh là P. italicum (TQ2) và P. digitatum (TQ1) ngoài ra còn có các giống nấm sợi nghiên cứu thuộc các giống Aspergillus niger (đ2), Aspergillus glaucus (V1), Penicillium citrinum (X1), Rhizopus oryzae (đ1). Với ựặc ựiểm hình thái khuẩn lạc chúng tôi ựã sơ bộ ựịnh ựược tên với các loại nấm sợi nghiên cứu
Chúng tôi xác ựịnh ựược nấm gây bệnh chủ yếu trên cam quýt sau thu hoạch là P. italicum (mốc xanh) và P. digitatum (mốc lục). Theo nội dung của ựề tài chúng tôi tập chung nghiên cứu về nấm mốc Penicillium digitatum và
Bảng 4.2: Một số ựặc ựiểm của 2 loài nấm P. italicum vàP. digitatum ựã phân lập ựược trên môi trường PSA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đặc ựiểm khuẩn lạc
Cấu trúc qua kắnh hiển vi Tên chủng
nấm mốc
24 giờ nuôi cấy 48 giờ nuôi cấy 72 giờ nuôi cấy 96 giờ nuôi cấy
Bào tử Hệ sợi nấm P. digitatum Hệ sợi nấm có màu trắng, có cả sợi nấm không màu, ựường kắnh của khuẩn lạc phát triển rõ rệt, ựường kắnh lên ựến 7mm Nấm bắt ựầu sinh bào tử nên ở giữa khuẩn lạc có màu xanh lục, xung quanh khuẩn lạc có màu trắng, ở ngoài cùng khuẩn lạc có các sợi nấm không màu, ựường kắnh khuẩn lạc tăng lên 25mm Lúc này sợi nấm sinh nhiều bào tử nên khuẩn lạc cáo màu xanh lục chiếm ưu thế hơn, các sợi nấm màu trắng và không màu ở ngoài cùng, ựường kắnh của khuẩn lạc 50mm. Khuẩn lạc có màu xanh lục ựó là màu của bào tử nấm, viền xung quanh có hệ sợi nấm màu trắng, ựường kắnh khuẩn lạc 70 mm.
Bào tử phân sinh không màu, khi tập hợp có màu xanh lục, ựơn bào hình bầu dục hoặc hình tròn nối liền thành chuỗi ở ựỉnh nhánh con
Sợi nấm không màu, ựường kắnh 4 Ờ 20 ộm Cành bào tử
phân sinh phân
nhánh 1 Ờ 2 lần, nhánh cuối có 2 Ờ 6 nhánh con, nhánh con không màu, thon
dài, ựỉnh không
đặc ựiểm khuẩn lạc
Cấu trúc qua kắnh hiển vi Tên chủng
nấm mốc 24 giờ nuôi cấy 48 giờ nuôi cấy 72 giờ nuôi cấy 96 giờ nuôi cấy
Bào tử Hệ sợi nấm P. italicum Hệ sợi nấm có màu trắng, có cả sợi nấm không màu, ựường kắnh của khuẩn lạc khoảng 5mm Nấm sinh bào tử nên ở giữa khuẩn lạc xuất hiện màu xanh, và xung quanh khuẩn lạc có màu trắng, ngoài cùng của khuẩn lạc có có sợi nấm không màu, ựường kắnh khuẩn lạc 20mm Khuẩn lạc có màu xanh, viền xung quanh có màu trắng, khuẩn lạc của nấm P. italicum mọc khác với khuẩn lạc của P. digitatum, ựường kắnh của khuẩn lạc lúc này khoảng 40 mm. Lúc này hệ sợi nấm sinh bào tử nên khuẩn lạc có màu xanh, chỉ có một viền mỏng bên ngoài có màu trắng, ựường kắnh lên ựến khoảng 55 mm.
Bào tử phân sinh không màu, khi tập hợp lại có màu xanh lam, ựơn bào hình bầu dục nối thành chuỗi ở trên ựỉnh nhánh con
Sợi nấm không màu, ựường kắnh 2 Ờ 12 ộm. cành bào tử phân sinh không màu, phân nhánh 3 lần, số nhánh con thường là 2 Ờ 4 nhánh, nhánh con không màu, hình dùi trống nhỏ, ựỉnh hơi nhọn
4.3. Ức chế sự phát triển của nấm mốc xanh ở các nồng ựộ etanol khác nhau trên môi trường PSA. trên môi trường PSA.
Bước tiếp theo của ựề tài chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của etanol tới sự phát triển của các chủng nấm mốc xanh ựã phân lập ựược. Các chủng nấm mốc ựược nuôi trong ựiều kiện phát triển tối ưu là ở nhiệt ựộ 30o và hoạt ựộ nước 0,99 với các nồng ựộ etanol thay ựổi lần lượt là 0%, 1%, 3%, 5% và kết quả ựược trình bày dưới ựây